乳品中大腸菌群快速檢測(cè)研究.pdf

1、近年來我國(guó)食品安全問題受到管理部門和消費(fèi)者的極大關(guān)注。食品微生物衛(wèi)生是食品安全中的重要環(huán)節(jié),微生物污染是食品安全的主要問題。大腸菌群作為食品衛(wèi)生評(píng)價(jià)的重要微生物檢測(cè)指標(biāo),在食品安全中受到嚴(yán)格監(jiān)控,食品中大腸菌群的檢測(cè)越來越受到生產(chǎn)企業(yè)和基層食品衛(wèi)生監(jiān)督檢測(cè)機(jī)構(gòu)的關(guān)注。
　　 我國(guó)乳品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群采用乳糖膽鹽九管發(fā)酵法,方法應(yīng)用成熟,儀器依賴程度低,但易受乳品基質(zhì)干擾,影響檢測(cè)結(jié)果的判讀,同時(shí)檢測(cè)耗時(shí)費(fèi)力(72 h),

2、難以滿足大量乳品樣本快速檢測(cè)的實(shí)際需要。隨著食品微生物檢測(cè)技術(shù)發(fā)展,酶分析法、分子生物學(xué)法、免疫法等新方法相繼出現(xiàn),但儀器試劑昂貴、操作專業(yè)性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高,難以在基層企業(yè)和衛(wèi)生監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)推廣。本研究以國(guó)標(biāo)法中乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基為基本營(yíng)養(yǎng)成分,分別研究構(gòu)建了檢測(cè)片法和細(xì)胞培養(yǎng)瓶劑法,并對(duì)模擬條件下的可逆性損傷大腸桿菌進(jìn)行了復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)研究。為探索適合乳品中大腸菌群快速檢測(cè)的方法和提高檢出率打下研究基礎(chǔ)。本論文的主要研究工作和結(jié)論如下:

3、r>　　 (1)建立了乳品中大腸菌群檢測(cè)片快速檢測(cè)方法,以國(guó)標(biāo)法中的乳糖發(fā)酵管培養(yǎng)基為基本營(yíng)養(yǎng)成分,遴選、優(yōu)化、添加輔助營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿指示劑、顯色劑、緩沖劑、修復(fù)劑、選擇性抑菌劑,通過冷水凝膠劑等均勻固化于基片上。樣品滴加檢測(cè)片上,培養(yǎng)16～18 h即可直接依據(jù)檢測(cè)片顏色的變化定量檢樣中大腸菌群的含量,結(jié)果既可用cfu／mL報(bào)告,也可以MPN形式報(bào)告。優(yōu)化后的(a)鮮乳檢測(cè)片配方(g.L-1):胰蛋白胨10.0,大豆蛋白胨5.0,乳糖

4、15.0,SDS0.1,磷酸氫二鉀4.0,氯化鈉3.0,聚丙烯酸鈉1.0,質(zhì)量濃度為2％的TTC溶液5 mL,質(zhì)量濃度為1.6 g／100mL溴甲酚紫溶液4 mL,蒸餾水1000 mL；(b)酸乳檢測(cè)片配方(g.L-1):胰蛋白胨10.0,大豆蛋白胨5.0,乳糖15.0,SDS0.1,磷酸氫二鉀20.0,氯化鈉3.0,聚丙烯酸鈉1.0,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的TTC溶液5 mL,質(zhì)量濃度為1.6g／100mL溴甲酚紫溶液4 mL,蒸餾水1000

5、 mL。檢測(cè)片對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌等7株菌株和市售乳制品樣本進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果表明,檢測(cè)片上的紅色菌落清晰明顯,菌落周圍黃暈顏色深淺適宜,檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng),靈敏度高,最低檢出限為0～4cfu／mL,報(bào)告結(jié)果可在18 h內(nèi)完成。實(shí)際使用檢測(cè)片法和國(guó)標(biāo)法對(duì)鮮乳、酸乳、奶粉各20份樣本進(jìn)行大腸菌群檢測(cè),兩方法所測(cè)結(jié)果的總符合率為96.7％,檢測(cè)結(jié)果經(jīng)x2檢驗(yàn),x2=0.50.05,表明兩方法檢出的陽性率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。

6、
　　 (2)研究了一種用于快速檢測(cè)大腸菌群的細(xì)胞培養(yǎng)瓶劑法,即以國(guó)標(biāo)法中的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)成分,經(jīng)濃縮、干燥后制成快速檢測(cè)瓶劑,以遴選的3.5 mol／LNaOH配制的百里香酚酞溶液作為產(chǎn)氣指示劑,并將其制成1×1cm規(guī)格產(chǎn)氣指示試紙。樣品滴加細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),培養(yǎng)24 h,依據(jù)培養(yǎng)瓶蓋上產(chǎn)氣指示試紙顏色變化及瓶?jī)?nèi)溶液顏色變化,確定可疑陽性樣品,并對(duì)其進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)及鏡檢,驗(yàn)證大腸菌群的存在性。實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶法進(jìn)行了大腸

7、菌群的重復(fù)性及實(shí)際樣品檢測(cè),并與國(guó)標(biāo)法進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示,細(xì)胞培養(yǎng)瓶法與國(guó)標(biāo)法所測(cè)結(jié)果符合率達(dá)96％,樣品檢測(cè)報(bào)告時(shí)間只需24 h,兩種方法所測(cè)結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P>0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶劑法表現(xiàn)出明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì),利于基層監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)企業(yè)對(duì)食品中大腸菌群的快速檢測(cè)。
　　 (3)通過60℃恒溫水浴和4℃酸環(huán)境冷藏兩種應(yīng)力對(duì)大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行亞致死誘導(dǎo),建立了不同處理方式和時(shí)間下的大腸桿菌損傷模型,并采用化學(xué)促進(jìn)法、雙

8、層平板法、雙層檢測(cè)片法對(duì)這兩種處理?xiàng)l件下的大腸桿菌進(jìn)行修復(fù)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果顯示,在化學(xué)促進(jìn)法中,氯化鎂、丙酮酸鈉及吐溫80可以使亞損傷菌體在選擇性培養(yǎng)基上不同程度地得以修復(fù),其中0.5％吐溫80與0.15％丙酮酸鈉的組合修復(fù)劑對(duì)4℃冷藏大腸桿菌的檢出數(shù)量提高較為顯著,相對(duì)檢出數(shù)量提高了66.4％,吐溫80與丙酮酸鈉的組合修復(fù)劑對(duì)熱損傷大腸桿菌的檢出數(shù)量提高明顯,較對(duì)照組檢出提高了131.2％。在雙層平板修復(fù)中,低溫和熱處理的大腸桿菌檢出數(shù)