大腸菌群檢測(cè)操作規(guī)范培訓(xùn)分析

1、大腸菌群檢測(cè)操作規(guī)范培訓(xùn),質(zhì)量管理部,目錄,一、細(xì)菌介紹二、大腸桿菌生物學(xué)特性三、大腸桿菌檢測(cè)儀器、設(shè)備四、檢測(cè)培養(yǎng)基及試劑五、檢測(cè)前培養(yǎng)基準(zhǔn)備六、接種培養(yǎng)七、MPN單位介紹八、檢測(cè)注意事項(xiàng),一、細(xì)菌介紹,細(xì)菌是單細(xì)胞原核微生物，個(gè)體微小（細(xì)胞直徑約0.5μm, 0.5-5μm），結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，細(xì)菌分布最廣、數(shù)量最多。,1、細(xì)菌的形態(tài),細(xì)菌個(gè)體微小、形態(tài)各異球菌桿菌弧菌與彎曲菌螺旋菌及螺

2、旋體不規(guī)則形,弧菌,2、細(xì)菌的結(jié)構(gòu),細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu)包括：細(xì)胞壁、 細(xì)胞膜、間體、細(xì)胞漿、核糖體、細(xì)胞質(zhì)。 細(xì)菌的附屬結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)粒、莢膜、鞭毛、菌毛和芽胞。,3、細(xì)菌的繁殖,細(xì)菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁殖。在分裂前先延長(zhǎng)菌體，染色體復(fù)制為二，然后垂直于長(zhǎng)軸分裂，細(xì)胞赤道附近的細(xì)胞質(zhì)膜凹陷生長(zhǎng)，直至形成橫隔膜，同時(shí)形成橫隔壁，這樣便產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞。,4、細(xì)菌的菌落,單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖后，會(huì)形成以母細(xì)胞為中心的一堆肉

3、眼可見(jiàn)、有一定形態(tài)構(gòu)造的子細(xì)胞集團(tuán)－菌落。,細(xì)菌菌落常表現(xiàn)為濕潤(rùn)、粘稠、光滑、較透明、易挑取、質(zhì)地均勻以及菌落正反面或邊緣與中央部位顏色一致等。,細(xì)菌的菌落圖,二、大腸桿菌生物學(xué)特性,大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。主要包括埃希氏菌、檸檬酸細(xì)菌、腸桿菌、克雷伯氏菌等，均屬于腸桿菌。,大腸菌群以大腸埃希氏菌為主，是革蘭氏陰性、兩端鈍圓的桿菌，無(wú)芽孢，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)或不運(yùn)動(dòng)。最適生長(zhǎng)溫度為37℃

4、，在42-44℃條件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍為15-46℃。,1、大腸桿菌平板菌落圖片,2、大腸桿菌革蘭氏染色圖片,3、大腸桿菌微菌落圖片,4、大腸桿菌透射電鏡圖片,,5、大腸桿菌掃描電鏡圖片,6、大腸桿菌分裂圖片,三、檢測(cè)儀器、設(shè)備,冰箱：0～4℃ 恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃ 恒溫水浴鍋：46±1℃ 微生物顯微鏡,架盤藥物天平：0g～500g，精確至0.5g 三角瓶：500ml 滅菌吸管：1ml、10ml

5、 滅菌平皿：直徑90mm 試管：18×180mm,四、檢測(cè)培養(yǎng)基及試劑,乳糖膽鹽發(fā)酵管伊紅美藍(lán)瓊脂乳糖發(fā)酵管革蘭氏染色液生理鹽水,乳糖膽鹽發(fā)酵管：用于大腸菌群的測(cè)定。35g乳糖膽鹽于1升蒸餾水中，溶解，分裝于發(fā)酵試管中，放入小倒管，115℃15分鐘高壓滅菌。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其它成分加倍。,乳糖發(fā)酵管：大腸菌群證實(shí)試驗(yàn)用。 30g乳糖于1升蒸餾水中，溶解，分裝于發(fā)酵試管中，放入小倒管，115℃15分鐘高壓

6、滅菌。,伊紅美蘭瓊脂：用于大腸菌群的固體平板檢測(cè)。 37.5g于1升蒸餾水中，搖勻，加熱煮沸，121℃15分鐘高壓滅菌。,五、檢測(cè)前培養(yǎng)基準(zhǔn)備,檢查預(yù)先經(jīng)過(guò)滅菌處理的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基小導(dǎo)管內(nèi)是否有氣體。按產(chǎn)品品種將培養(yǎng)基分別放在試管架內(nèi)，同時(shí)將9ml 0.85%滅菌鹽水管也放入相應(yīng)的試管架內(nèi)。,六、接種培養(yǎng),（一）酸牛奶系列產(chǎn)品酸牛奶系列產(chǎn)品接種單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基9支管，分別接種樣品量為1ml (原濃度)3支，0.1ml (1

7、0-1濃度)3支，0.01ml (10-2濃度)3支。,1、 1ml接種培養(yǎng),在無(wú)菌條件下，用1ml滅菌吸管吸取1ml樣品試液于含有9ml0.85%滅菌鹽水試管中，振蕩搖勻制成1:10的稀釋液；同時(shí)分別吸取1ml樣品試液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。,2、 0.1ml接種培養(yǎng),另?yè)Q1根1ml滅菌移液管吸取1:10的稀釋液1ml于含有9ml0.85%滅菌鹽水試管中，振蕩搖勻制成1:100的稀釋液；同時(shí)分別吸取1m

8、l 1:10稀釋液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。,3、 0.01ml接種培養(yǎng),另?yè)Q1根1ml滅菌移液管分別吸取1ml 1:100稀釋液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。,,4、接種過(guò)程操作錄像檢測(cè)\單料大腸檢測(cè).MPG,討論,錄像中存在的問(wèn)題：1、整個(gè)微生物檢測(cè)前應(yīng)先消毒手。2、為了盡量減少污染，接種培養(yǎng)時(shí)先接生理鹽水管再接乳糖膽鹽發(fā)酵管。3、拿刻度吸管時(shí)，注意用手托住吸管筒

9、輕輕抖出。4、先熄滅酒精燈再擦拭操作臺(tái)和酒精燈。5、剪刀用完后及時(shí)的進(jìn)行擦拭干凈。,5、接種后培養(yǎng),將接種完的試管連同試管架一起置于36±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h，觀察乳糖膽鹽發(fā)酵管的變化情況。,6、結(jié)果查詢并記錄,若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則報(bào)告大腸菌群陰性。若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則要做證實(shí)試驗(yàn)。,（二）活性乳酸菌飲料系列產(chǎn)品,活性乳酸菌飲料系列產(chǎn)品接種雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基3支管，單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基

10、6支，分別接種樣品量為10ml 3支，1ml 3支，0.1ml 3支。,1、 10ml接種培養(yǎng),在無(wú)菌條件下，用1ml滅菌吸管吸取1ml樣品試液于含有9ml0.85%滅菌鹽水試管中，振蕩搖勻制成1:10的稀釋液；同時(shí)用10ml滅菌吸管分別吸取10ml樣品試液于3支雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。,2、 1ml接種培養(yǎng),另用1ml滅菌移液管分別吸取1ml 樣品試液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。,

11、3、 0.1ml接種培養(yǎng),另?yè)Q1根1ml滅菌移液管分別吸取1ml 1:10稀釋液于3支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，并輕微振蕩搖勻，放入原位置。,,4、接種過(guò)程操作錄像檢測(cè)\雙料大腸檢測(cè).MPG,討論,錄像中存在的細(xì)節(jié)問(wèn)題：1、整個(gè)微生物檢測(cè)前應(yīng)先消毒手。2、為了盡量減少污染，接種培養(yǎng)時(shí)先接生理鹽水管再接乳糖膽鹽發(fā)酵管。3、拿刻度吸管時(shí)，注意用手托住吸管筒輕輕抖出。4、先熄滅酒精燈再擦拭操作臺(tái)和酒精燈。5、剪刀用完后及時(shí)的進(jìn)行擦拭干凈

12、。,5、接種后培養(yǎng),將接種完的試管連同試管架一起置于36±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h，觀察乳糖膽鹽發(fā)酵管的變化情況。,6、結(jié)果查詢并記錄,若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則報(bào)告大腸菌群陰性。 若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則要做證實(shí)試驗(yàn)。,（三）證實(shí)試驗(yàn),1、伊紅美藍(lán)瓊脂平板分離將產(chǎn)酸產(chǎn)氣乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)的培養(yǎng)物分別接種于伊紅美蘭瓊脂平板(劃線分離)，置于36±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h。,接種和分離工

13、具,1．接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀,平板分離畫線法,1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,將伊紅美藍(lán)瓊脂平板從培養(yǎng)箱取出后,觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。革蘭氏染色：見(jiàn)《革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范》。,（四）乳糖發(fā)酵試驗(yàn),挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色后接種乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，置于36±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情

14、況。,凡是革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣的菌落即可報(bào)告大腸菌群陽(yáng)性。,,根據(jù)證實(shí)為大腸菌群的陽(yáng)性管數(shù)，查MPN檢索表，查找每100ml樣品內(nèi)的大腸菌群的MPN值。,七、MPN單位介紹,MPN=Most Probable Number ，最大可能數(shù) ，是一種利用統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)微生物的方法。食品大腸菌群是以每克或100ML中大腸菌群的最近似值，是用MPN來(lái)表示。,采用9管法，對(duì)樣品選三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管相應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，

15、然后根據(jù)情況做出判斷陽(yáng)性和陰性，再根據(jù)不同稀釋度的陽(yáng)性管數(shù)查表即可得到被測(cè)樣品相應(yīng)指標(biāo)的MPN值。,八、注意事項(xiàng),乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)小導(dǎo)管內(nèi)如無(wú)氣泡，需輕振試管，若有氣泡上冒，也算產(chǎn)氣。 在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的菌落如為深紫色有金屬光澤，則為典型菌落，98%以上為大腸菌群。,革蘭氏染色和乳糖復(fù)發(fā)酵時(shí)如有典型菌落，則挑取典型菌落；無(wú)典型菌落，應(yīng)挑取紅色和粉色菌落。如果只有紅色或粉色菌落，應(yīng)挑取3個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，并接種乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。如