藥物分析生物藥物分析

1、第十章,生物藥物分析,基本要求,1．熟悉生物藥物的范圍、種類(lèi)和特點(diǎn)。2．掌握生物藥物質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法類(lèi)型。3．了解本類(lèi)藥物含量測(cè)定的方法。,事故案例,2008年5月22日至28日，有6名在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院就醫(yī)的患者，使用江西某制藥公司生產(chǎn)的批號(hào)為20070514的靜脈注射用人免疫球蛋白（pH4）后死亡。江西省食品藥品監(jiān)督管理局采取緊急措施，對(duì)相關(guān)藥品和資料進(jìn)行封存，并責(zé)成該企業(yè)迅速召回該批次產(chǎn)品。抽取樣品送中國(guó)藥品生

2、物制品檢定所檢驗(yàn)，對(duì)相關(guān)藥品和資料進(jìn)行封存。,一、概述,化學(xué)藥物中 藥生物藥物,人類(lèi)用于預(yù)防、診斷和治療疾病的三大類(lèi)藥物,,生物藥物的定義： 利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合運(yùn)用化學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理與方法制得的一大類(lèi)藥物。,1. 生物藥物的分類(lèi)（Ⅰ）,生物藥物按來(lái)源和生產(chǎn)方法可分為：生化藥物：從動(dòng)物、植物及微生物等生物體中分離提取的，以及用生物-化學(xué)合成、微

3、生物合成或現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物等一類(lèi)藥物。,氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、多糖、核苷酸類(lèi)等。如丙氨酸、硫酸魚(yú)精蛋白、氟尿嘧啶等。,1. 生物藥物的分類(lèi)（Ⅰ）,生物技術(shù)藥物：應(yīng)用基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等現(xiàn)代生物技術(shù)獲得的藥物。生物制品：用微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源的組織和體液等生物材料為原料制備的藥物。,細(xì)菌類(lèi)疫苗、病毒類(lèi)疫苗、抗毒素及抗血清、生長(zhǎng)因子、單克隆抗體等,人干擾素、人白細(xì)胞介素、促紅

4、細(xì)胞生成素、重組融合蛋白等,1. 生物藥物的分類(lèi)（Ⅱ）,按化學(xué)本質(zhì)和化學(xué)特性可分為：氨基酸及其衍生物類(lèi) 蛋氨酸 谷氨酸 丙氨酸多肽和蛋白質(zhì)類(lèi) 催產(chǎn)素 血清白蛋白 胰島素酶和輔酶類(lèi) 胃蛋白酶 門(mén)冬酰胺酶 凝血酶核酸及其降解物和衍生物類(lèi) 5-氟尿嘧啶 6-硫代嘌呤多糖類(lèi) 肝素 人參多糖 透明質(zhì)酸鈉 脂類(lèi) 卵磷脂 膽紅素 前列腺素系列（ PGE1、PGE2和PG12 ）細(xì)胞生長(zhǎng)因子類(lèi) 生長(zhǎng)素 白細(xì)

5、胞介素 腫瘤壞死因子生物制品類(lèi) 疫苗,2. 生物藥物的特點(diǎn),① 生物藥物的治療針對(duì)性強(qiáng)，藥理活性高。 細(xì)胞色素C用于治療組織缺氧所引起的一系列疾病。 注射用的純ATP可以直接供給機(jī)體能量。② 原料中的有效物質(zhì)含量低，穩(wěn)定性差 激素、酶在體內(nèi)含量極低，且容易失活。生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)低溫、無(wú)菌。③ 毒副作用小，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。 蛋白質(zhì)、核酸、多糖類(lèi)、脂類(lèi)等藥物本身就直接取自體內(nèi)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)

6、值很高。,3. 生物藥物分析的特點(diǎn),① 全過(guò)程的質(zhì)量控制 此類(lèi)藥物對(duì)熱、酸、堿、重金屬以及pH較敏感，生物活性易發(fā)生變化，需對(duì)原材料、生產(chǎn)過(guò)程和最終產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。② 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 除氨基酸、核苷酸、輔酶及甾體激素等屬化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的小分子化合物外，大部分為大分子物質(zhì)，其分子量一般幾千至幾十萬(wàn)。對(duì)大分子的藥物而言，即使組分相同，往往由于分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。,3. 生物藥物分析的特點(diǎn),③ 生物

7、活性檢查 多肽或蛋白質(zhì)類(lèi)藥物在制備過(guò)程中容易失活。因此，需用生物檢定法證實(shí)藥物的生物活性。 ④ 安全性檢查 生物藥物多從生物材料中提取，有可能引入特殊雜質(zhì)、病菌和毒素等污染物，因此需進(jìn)行安全性檢查，如熱原和細(xì)菌內(nèi)素檢查、異常毒性試驗(yàn)、過(guò)敏性試驗(yàn)、無(wú)菌檢查等。,例,尿激酶是由新鮮人尿中提取的一種蛋白水解酶，具有溶解血栓的作用，但由于人尿中也含有凝血活性物質(zhì)，其含量過(guò)高會(huì)使血液呈高凝狀態(tài)，易并發(fā)腦血栓，因此必須

8、對(duì)其做限量檢查。,3. 生物藥物分析的特點(diǎn),⑤ 含量（效價(jià)）測(cè)定 對(duì)酶類(lèi)藥物需進(jìn)行效價(jià)測(cè)定或酶活力測(cè)定，以表明其活性成分含量的高低。⑥ 生化法確證結(jié)構(gòu) 在此類(lèi)藥物中，由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)的確證很難沿用元素分析、IR、UV、NMR、MS等方法加以證實(shí)，往往還要用生化法如氨基酸序列、肽圖分析等法加以證實(shí)。,生化藥物質(zhì)量控制的項(xiàng)目： 來(lái)源與種類(lèi) 純度

9、 性狀 干燥失重或水分 鑒別 熾灼殘?jiān)?氨基酸組分分析 生物活性 肽圖 熱源試驗(yàn) 糖含量 含量分析,二、生物藥物的質(zhì)量檢定,二、生物藥物的質(zhì)量檢定(Ⅰ),1. 鑒別試驗(yàn) 利用化學(xué)法、物理法及生物學(xué)方法來(lái)確證生化藥物的真?zhèn)?。用?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吩谕粭l件下進(jìn)行對(duì)照試

10、驗(yàn)。① 理化鑒別 —化學(xué)鑒別法 呈色反應(yīng)、沉淀反應(yīng) —UV法 紫外特征吸收 —HPLC法 色譜圖的保留時(shí)間和肽圖譜,化學(xué)鑒別法,溶菌酶的鑒別采用呈色法，溶菌酶分子中的四個(gè)肽鍵上的氮原子能與銅離子絡(luò)合生成有顏色的配位化合物。肽鍵越多，顏色越深。 溶菌酶： — CONH — + Cu2+ →絡(luò)合顯色胃蛋白酶是具有高效、專(zhuān)一催化活性的特殊蛋白質(zhì)，與酸、堿、重金屬或有機(jī)溶劑作用引起蛋白質(zhì)變性，生成沉

11、淀。,光譜法——UV法和IR法,細(xì)胞色素C是以含鐵卟啉為輔基的結(jié)合蛋白，在磷酸鹽緩沖液（pH7.3）中，還原型在550、520、415nm處有最大吸收；氧化型在280、361、410與529nm處有最大吸收。三磷酸鹽腺苷二鈉、門(mén)冬氨酸、色氨酸等氨基酸類(lèi)藥物采用IR鑒別，將供試品的IR圖譜與對(duì)照品的IR圖譜進(jìn)行比對(duì)。,HPLC法,胰島素的鑒別 采用HPLC法，固定相為ODS，柱溫40℃，流動(dòng)相為0.1mol/L磷酸二氫鈉溶

12、液（pH3.0）-乙腈（73:27），檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。重組人生長(zhǎng)激素 —供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與相應(yīng)對(duì)照品的保留時(shí)間一致； —肽圖譜供試品與對(duì)照品一致。,肽譜圖是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小和氨基酸組成特點(diǎn)，使用專(zhuān)一性較強(qiáng)的蛋白水解酶，將蛋白質(zhì)裂解成較小的片段，經(jīng)分離檢測(cè)形成特征性指紋圖譜。肽譜圖對(duì)每一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)都是特征和專(zhuān)一的。,1. 鑒別試驗(yàn)(Ⅱ),② 生化鑒別 —酶法 利用酶對(duì)底物特異性的催化活力，作為酶類(lèi)生

13、物制品的鑒別。 尿激酶的鑒別:,1. 鑒別試驗(yàn)(Ⅱ),② 生化鑒別—電泳法 用于蛋白質(zhì)、核苷酸類(lèi)生物制品的鑒別。肝素鑒別： —免疫法,與肝素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，其移動(dòng)位置一致。,1. 鑒別試驗(yàn)(Ⅲ),③ 生物鑒別 利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)鑒別藥物，如采用小鼠血糖法鑒別胰島素。 胰島素的鑒別試驗(yàn)：取本品適量，用pH2.5~3.0的水配制成5U/ml的溶液，在20~30℃取體重為20~24g的

14、小鼠5只，按0.25ml/20g體重的劑量皮下注射胰島素溶液，2h內(nèi)至少應(yīng)有4只小鼠發(fā)生驚厥。立即給驚厥的小鼠腹腔10%葡萄糖注射液1ml，應(yīng)能使驚厥停止。,2. 雜質(zhì)檢查,①一般雜質(zhì)檢查 檢查項(xiàng)目包括氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及干燥失重、熾灼殘?jiān)取?檢查的原理及方法與化學(xué)藥物雜質(zhì)檢查相同。,② 特殊雜質(zhì)檢查（Ⅰ）,許多藥物是從生物組織中提取或用微

15、生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。 如臟器生化藥物是從動(dòng)物的組織、腺體、分泌物等提取的藥物。腦磷脂、腦活素來(lái)自于大腦 輔酶A來(lái)自于肝臟胃蛋白酶來(lái)自于胃 硫酸軟骨素來(lái)自于骨尿激酶來(lái)自于尿 組氨酸、賴氨酸來(lái)自于血人工牛黃來(lái)自于膽汁 胰島素來(lái)自于胰腺等。,② 特殊雜質(zhì)檢查（Ⅱ）,原料藥的純度分析生

16、產(chǎn)過(guò)程中雜質(zhì)檢查貯存過(guò)程中雜質(zhì)檢查 胰島素是一種分子量較小的激素蛋白，必須從動(dòng)物的胰臟中提取，在胰島素的制備過(guò)程中引入的有關(guān)蛋白和大分子蛋白需加以控制，對(duì)于有關(guān)蛋白的檢查，ChP采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，BP采用HPLC法。大分子蛋白的檢查，ChP和BP均采用分子排阻色譜法。,例,3. 安全性檢查(Ⅰ),熱原和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（家兔法、鱟試劑）無(wú)菌檢查 用于要求無(wú)菌的生物制品及相關(guān)輔料異常毒性試驗(yàn) 用

17、一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗(yàn)動(dòng)物死亡與否為終點(diǎn)。 小鼠試驗(yàn) 豚鼠試驗(yàn),3. 安全性檢查(Ⅱ),過(guò)敏試驗(yàn)（檢查異性蛋白） 藥物中若夾雜有異性蛋白，在臨床使用時(shí)易引起病人多種過(guò)敏反應(yīng)，輕者皮膚出現(xiàn)紅斑或丘疹，嚴(yán)重者可出現(xiàn)窒息、血管神經(jīng)性水腫、血壓下降，甚至休克和死亡。 細(xì)胞色素C溶液的過(guò)敏試驗(yàn) 依藥典方法將一定量的供試品溶液注射給豚鼠

18、，觀察期內(nèi)不得出現(xiàn)過(guò)敏性反應(yīng)。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔或咳嗽3聲等現(xiàn)象中的兩種或以上者，或有啰音、抽搐、虛脫或死亡等現(xiàn)象之一者，應(yīng)判為陽(yáng)性。,例,3. 安全性檢查(Ⅲ),降壓物質(zhì)檢查法 包括組胺、類(lèi)組胺在內(nèi)的能導(dǎo)致血壓降低的物質(zhì)。 來(lái)源：用動(dòng)物臟器或組織為原料制備生化藥物，正常組織內(nèi)存在的組胺及部分氨基酸脫羧形成的組胺、酪胺等膠類(lèi)物質(zhì)。方法：將組胺對(duì)照品稀釋液與供試品稀釋液靜脈注入麻醉貓（狗），比較兩者引起的血壓下

19、降程度，以判定供試品中所含降壓物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定。,3.含量（效價(jià)）測(cè)定,定量表征生物藥物的方法 —用百分含量表示，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。 —用生物效價(jià)或酶活力單位表示，適用于酶類(lèi)和蛋白質(zhì)類(lèi)等藥物的測(cè)定。常用的含量（效價(jià)）測(cè)定方法理化分析法、生化測(cè)定法、生物檢定法,①理化分析法,化學(xué)分析法—重量法：根據(jù)樣品中分離出的單質(zhì)或化合物的重量測(cè)定所含成分的含量。（1）提取法

20、 （2）揮發(fā)法 （3）沉淀法,用適宜的溶劑提取樣品中的待測(cè)成分，再蒸去溶劑進(jìn)行測(cè)定。,利用被測(cè)組分具有揮發(fā)性，或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。,利用沉淀反應(yīng)，將被測(cè)組分轉(zhuǎn)化為沉淀分離出來(lái)，然后經(jīng)過(guò)濾、烘干或熾灼，最后稱重計(jì)算其含量。,①理化分析法,—滴定分析法：根據(jù)樣品中某些成分與標(biāo)準(zhǔn)溶液能定量地發(fā)生中和、氧化還原或絡(luò)合反應(yīng)等進(jìn)行測(cè)定。利用氨基酸類(lèi)藥物分子中氨基的堿性，可采用非水溶液滴定法測(cè)定含量，如色氨酸、蘇氨酸、

21、組氨酸、L-門(mén)冬氨酸、L-丙氨酸等。谷氨酸利用羧基的酸性采用中和滴定法測(cè)定。甘露醇和山梨醇均采用碘量法測(cè)定含量。,①理化分析法（Ⅱ）,電化學(xué)分析法,①理化分析法（Ⅲ）,光譜分析法—比色法：樣品與顯色劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，依顏色反應(yīng)的強(qiáng)度測(cè)定含量。如蛋白質(zhì)的含量測(cè)定，可利用蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)，而進(jìn)行定量測(cè)定?！猆V法：樣品或轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物在某一波長(zhǎng)處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸收度成正比，則可進(jìn)行定量測(cè)定。如蛋

22、白質(zhì)在280nm左右有最大吸收 ?！獰晒夥止夤舛确ǎ焊鶕?jù)物質(zhì)被UV光照射后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測(cè)定。,①理化分析法（Ⅳ）,色譜分析法—HPLC法（1）RP-HPLC法：適用于肽類(lèi)、氨基酸、蛋白質(zhì)和多糖的測(cè)定，如生白能的含量測(cè)定。固定相：C8、C18烷基硅烷鍵合相流動(dòng)相：甲醇-水、乙腈-水（甲醇）、乙腈-緩沖液檢測(cè)器：紫外、熒光或電化學(xué)檢測(cè)器（2）高效離子交換色譜法（HPGEC）（3）高效凝膠過(guò)濾色譜法（HPGFC）,①

23、理化分析法,—高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）HPCE是根據(jù)帶電組分在管中由于其所帶電荷和分子量的大小，即荷質(zhì)比不同產(chǎn)生不同的遷移速度而分離。在生物藥物的分離分析中應(yīng)用廣泛。如氨基酸的分離、蛋白質(zhì)的分離及其分子量的測(cè)定、DNA合成中產(chǎn)物純度的測(cè)定等。,②生化測(cè)定法,酶活力測(cè)定法：以酶為分析對(duì)象，測(cè)定樣品中某種酶的活力或活性，并用活性單位（IU）和比活性(1mg酶的活性單位)表示 。酶分析法：以酶為分析工具或分析試劑，測(cè)定樣品中酶以外的

24、其它物質(zhì)的含量。,,類(lèi)型,酶法,一）酶活力測(cè)定法,定義： 酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的測(cè)定實(shí)際上是測(cè)定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度─可以用單位時(shí)間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示。酶活力測(cè)定的目的就是要通過(guò)酶反應(yīng)速率的測(cè)定，求得酶的濃度或含量。,一）酶活力測(cè)定法,測(cè)定方法取樣測(cè)定法：將酶與底物混合反應(yīng)一定時(shí)間后，取出一定量反應(yīng)液停止反應(yīng)，定量測(cè)定底物減少或產(chǎn)物生成的量，求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)的變化量

25、。如藥典收載胃蛋白酶的效價(jià)測(cè)定連續(xù)測(cè)定法：將酶和底物混合后隔一定時(shí)間，間斷地或連續(xù)地測(cè)定反應(yīng)的連續(xù)變化。藥典中胰蛋白酶的效價(jià)測(cè)定,二）酶分析法,總變量分析法（平衡法或終點(diǎn)法）： 根據(jù)被測(cè)物質(zhì)（底物）的性質(zhì)，選擇適宜的分析工具酶對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行作用，在反應(yīng)完成后，借助理化方法測(cè)出其總變化量，并參考反應(yīng)的平衡點(diǎn)，計(jì)算出被測(cè)物的實(shí)際含量或濃度。,二）酶分析法,2. 動(dòng)力學(xué)分析法（反應(yīng)速率法）： 通過(guò)條件控制，分

26、別使底物、輔酶活化劑或抑制劑的濃度在酶反應(yīng)中起決定反應(yīng)速度的主導(dǎo)作用。則酶的反應(yīng)速度和上述相應(yīng)因素的濃度間將具有確定的比例關(guān)系，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)速度即可求出它們的濃度。,③生物檢定法,生物檢定法是利用藥物對(duì)生物體（整體動(dòng)物、離體組織、微生物等）的作用以測(cè)定其效價(jià)或生物活性的一種方法。應(yīng)用1、藥物的效價(jià)：適用于測(cè)定一些采用理化方法不能測(cè)定含量或理化測(cè)定不能反映臨床生物活性的藥物。如洋地黃、胰島素、肝素及各種抗生素。,③生物檢定法,2、微