藥物分析生物堿

1、第八?章 生物堿類藥物的分析,生物堿（alkaloids）：是一類存在于生物體內(nèi)的含氮的堿性有機(jī)藥物，絕大部分存在于植物體內(nèi)，大多有強(qiáng)烈的生理活性。生物堿大都有毒性。目前已分離到生物堿3000多種，近百種具有強(qiáng)烈生理活性。藥物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)鑒別試驗特殊雜質(zhì)的檢查含量測定,第一節(jié) 藥物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),六類苯烴胺類托烷類喹啉類異喹啉類吲哚類黃嘌呤類,一、苯烴胺類（麻黃堿、偽麻黃堿、秋水仙堿、益母草堿）,HCl

2、 HCl 鹽酸麻黃堿 鹽酸偽麻黃堿 秋水仙堿Ephedrine hydrochloride pseudoephedrine hydrochloride colchicin,,,,,結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì),

3、1. 苯烴胺結(jié)構(gòu) N原子在側(cè)鏈上 ? 脂肪胺 ? 堿性強(qiáng)? 易與酸成鹽2. 芳環(huán)和不飽和雙鍵 紫外區(qū)有吸收3. 不對稱碳原子 手性特征 比旋度: 鹽酸麻黃堿 –33°C ~ –35.5°C 鹽酸偽麻黃堿 +61.0°C ~ +62.5°C

4、 秋水仙堿(左旋體) –425°C ~ –450°C,二、托烷類（顛茄生物堿類、古柯生物堿類）,H2SO4 ?H2O HBr 2 硫酸阿托品

5、 氫溴酸山莨菪堿 atropine sulfate anisodamine hydrobromide,,,,,結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì),1. 酯類生物堿 莨菪烷衍生物+莨菪酸 縮合 酯類生物堿 易水解 2. N原子 N原子位于五元脂環(huán) 堿性較強(qiáng)

6、 易與酸成鹽3. 不對稱碳原子 硫酸阿托品 外消旋體 無旋光性 氫溴酸山莨菪堿 左旋體 比旋度: – 9.0°C~–11.5 °C 4. 性狀 硫酸阿托品: 無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末 氫溴酸山莨菪堿: 白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末,,,,,,,三

7、、喹啉類（奎寧、奎尼丁、喜樹堿）,H2SO4 ?2H2O H2SO4 ?2H2O

8、 2 2 硫酸奎寧 硫酸奎尼丁 quinine sulfate

9、 quinidine sulfate,,,,,結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì),1. N原子堿性 喹啉環(huán) + 喹核堿 各含一個N原子 (芳環(huán)N)堿性 < (脂環(huán)N)堿性 與硫酸成鹽 不能2. 不對稱碳原子 奎寧; 奎尼丁 分子

10、式相同; 喹核堿部分的立體結(jié)構(gòu)不同 (左旋體) (右旋體)3.熒光特性（硫酸奎寧、硫酸奎尼丁在硫酸溶液中顯藍(lán)色熒光）4. 溶解性、藥理作用 不同 奎寧[ 氯仿-無水乙醇（2:1）易溶] 奎尼丁[ 沸水；乙醇易溶],,,,,,,四、異喹啉類（嗎啡、可待因、罌粟堿、那可?。?鹽酸嗎啡

11、 磷酸可待因 morphine hydrochloride codeine phospate,,,,,結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì),1. 酸堿性 嗎啡分子(叔胺基團(tuán)+酚羥基) 兩性化合物 堿性略強(qiáng) 可待因分子(叔胺基團(tuán), 無酚羥基)

12、 堿性較嗎啡強(qiáng)2. 溶解性 嗎啡、可待因在常用的有機(jī)溶劑（氯仿、乙醚）中，溶解度均較小。,,,,五、吲哚類(士的寧、利血平、麥角新堿、長春堿、長春新堿、毒扁豆堿、鉤藤堿),硝酸士的寧 利血平 strychnine nitrate

13、 reserpine,,,結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì),1. 堿性 ：兩個堿性強(qiáng)弱不同的N原子 脂肪鏈上N1 吲哚N2 叔胺碳?堿性較強(qiáng) 與芳環(huán)共軛?幾乎

14、無堿性士的寧：pKb1 為6.0 (與一分子硝酸成鹽) pKb2 為11.7利血平：N1 受立體效應(yīng)影響，堿性極弱 pKb1 為7.93 （不與酸成鹽）2. 性狀、溶解性士的寧：無色針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，沸水中易溶，水中略溶，乙醇或氯仿中微溶，乙醚中幾乎不溶。利血平：白色或淡褐色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，氯仿中易溶，丙酮或苯中微溶，水、甲醇、乙醇、乙醚中幾乎不

15、溶。比旋度測定用氯仿作溶劑，比旋度-115°C~-131°C,,,六、黃嘌呤類 （咖啡因、茶堿）,咖啡因 茶堿 caffeine theophylline,,,,,結(jié)構(gòu)特

16、征和性質(zhì),1. 結(jié)構(gòu)特征： 咪唑和嘧啶相駢合的雙雜環(huán)化合物2. 分子結(jié)構(gòu)含四個氮原子 ? 受鄰位羰基吸電子基團(tuán)影響，堿性弱，不易與酸結(jié)合成鹽 ? 臨床應(yīng)用為游離堿。3. 茶堿分子中含活潑氫 可與乙二胺成鹽,,第二節(jié) 鑒別試驗,生物堿類藥物的一般鑒別反應(yīng) 熔點(diǎn)測定法 紫外分光光度法 顯色反應(yīng)

17、 紅外分光光度法 沉淀反應(yīng) 色譜法生物堿類藥物的特殊鑒別反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng) Vitaili反應(yīng) 綠奎寧（Thakkeioquin）反應(yīng) 紫脲酸銨反應(yīng) Marquis反應(yīng),一、生物堿類藥物的一般鑒別反應(yīng),（一）熔點(diǎn)測定法： ChP：可

18、可堿、氨茶堿、磷酸可待因 BP： 茶堿（二）顯色反應(yīng)： 生物堿+生物堿顯色劑 脫水、氧化、縮合 不同的顏色 （濃硫酸、濃硝酸、鉬硫酸、釩硫酸、硒硫酸、甲醛硫酸）（三）沉淀反應(yīng)： 生物堿+重金屬鹽類、大分子酸類沉淀劑 沉淀 (碘化鉍鉀、碘化汞鉀、碘-碘化鉀、二氯化汞)

19、 (難溶鹽、不溶性鹽 復(fù)鹽、絡(luò)鹽沉淀),,,生物堿類藥物的一般鑒別反應(yīng),（四）紫外分光光度法：芳環(huán)、共軛雙鍵 1.比較最大吸收波長、最小吸收波長、相應(yīng)吸收度變化值 2.與對照品比較吸收

20、光譜的一致性 3.比較吸收系數(shù)的一致性（五）紅外分光光度法：反映分子結(jié)構(gòu)的細(xì)微特征，準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng) 鑒別藥物真?zhèn)蔚挠行Х椒ā＃ǜ鲊幍鋸V泛采用，鑒別生物堿的主要方法之一）標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜對照法；對照品對比法,,生物堿類藥物的一般鑒別反應(yīng),（六）色譜法：常用于生物堿類藥物的鑒別 薄層色譜法 最常用關(guān)鍵問題：拖尾現(xiàn)象

21、應(yīng)使生物堿以游離形式存在！ 解決辦法： 展開劑中加堿性試劑 制薄層板時硅膠中加入堿性試劑,,二、生物堿類藥物的特殊鑒別反應(yīng),（一）雙縮脲反應(yīng)： 芳環(huán)側(cè)鏈具有氨基醇結(jié)構(gòu)的特征反應(yīng) （鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿） 鹽酸偽麻黃堿Cu2+ +仲胺基?紫堇色配位化合

22、物無水、2分子水的配位化合物易溶于乙醚 ?紫紅色4分子水配合物溶于水層藍(lán)色 藍(lán)紫色，加乙醚，醚層紫紅色

23、 水層顯藍(lán)色,,生物堿類藥物的特殊鑒別反應(yīng),（二）Vitaili反應(yīng)：托烷類生物堿的特征反應(yīng) 山莨菪堿水解產(chǎn)物 + 3HNO3 ? + 3H2O

24、 莨菪酸三硝基衍生物（黃色）

25、 + KOH +H2O + CO2 ? 深紫色,,,生物堿

26、類藥物的特殊鑒別反應(yīng),（三）綠奎寧反應(yīng)：含氧喹啉衍生物的特征反應(yīng) Br2 NH3 ?H2O

27、 翠綠色,,,生物堿類藥物的特殊鑒別反應(yīng),（四）紫脲酸銨反應(yīng)：黃嘌呤類生物堿的特征反應(yīng) HCl

28、 NH3 KClO3 紫色（加NaOH試液，紫色消失）,,,生物堿類藥物的特殊鑒別反應(yīng),（五）甲醛-硫酸反應(yīng)（Marquis反應(yīng)）

29、 含酚羥基異喹啉生物堿的特征反應(yīng) 嗎啡、乙基嗎啡、可待因 + 甲醛-硫酸 有色化合物 醌式結(jié)構(gòu)例：鹽酸嗎啡 紫色,,,,第三節(jié) 特殊雜質(zhì)的檢查,一、顯

30、色反應(yīng)：1. 鹽酸嗎啡中阿撲嗎啡的檢查: 雜質(zhì)來源: 嗎啡 酸性?溶液 脫水 分子重排 阿撲嗎啡 雜質(zhì)檢查: 水溶液 碳酸氫鈉堿性 I2氧化 水溶性綠色化合物 (溶于乙醚?深寶石紅色) 雜質(zhì)限量: 規(guī)定50m

31、g藥物經(jīng)檢查醚層和水層不得顯色.2. 鹽酸嗎啡中罌粟酸的檢查: 雜質(zhì)來源(提取時引入) 雜質(zhì)檢查: 罌粟酸 微酸性溶液 FeCl3 罌粟酸鐵(紅色) 雜質(zhì)限量: 規(guī)定0.15g藥物中不得顯色3. 磷酸可待因中嗎啡的檢查: 雜質(zhì)來源(可待因合成中甲基化不完全引入嗎啡) 雜質(zhì)檢查: 嗎啡 + 亞硝酸鈉 2-亞硝基

32、嗎啡(氨堿性黃棕色) 雜質(zhì)限量: 0.10%,,,,,,,,,二、旋光度法,利用生物堿類藥物與特殊雜質(zhì)旋光性質(zhì)的差異例：硫酸阿托品中“莨菪堿”的檢查： （消旋） （左旋） 消旋不完全引入 雜質(zhì)限量：供試品溶液濃度50mg/ml, 旋光度不得過-0.4°。限量：2

33、4.6%。 （已知莨菪堿[? ] 為-32.5°）,,三、色譜法,利用生物堿類藥物與特殊雜質(zhì)在色譜行為上的差異主要以薄層色譜法為主（堿性試劑，防止拖尾）例：中國藥典硫酸奎尼丁中其它金雞納堿的檢查祥見（P206）中國藥典硫酸長春堿中其它生物堿的檢查 BP氫溴酸東莨菪堿中易氧化物的檢查祥見（P211） 中國藥典、BP氧氟沙星有關(guān)物質(zhì)的檢查祥見（P207）,第四節(jié) 含量測定,生物堿類藥物的含量測定多利用其

34、堿性非水溶液滴定法提取酸堿滴定法酸性染料比色法高效液相色譜法氣相色譜法,一、非水溶液滴定法,（一）原理和方法： 游離生物堿：B + HClO4 BH+? ClO 生物堿鹽： BH+? A– + HClO4 BH+? ClO +HA （置換反應(yīng)） 測定方法：取經(jīng)適當(dāng)方法干燥的供試品適量，加冰醋

35、酸10~30ml溶解。若供試品為氫鹵酸鹽，應(yīng)加5%醋酸汞的冰醋酸溶液3~5ml，用0.1mol/L的高氯酸滴定液滴定至終點(diǎn)，并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。 在冰醋酸中，只要在水溶液的Kb 值大于10-10 ，都能順利滴定。,,,非水溶液滴定法,（二）問題的討論：1. 適用范圍：在水溶液中不能被滴定的生物堿及鹽 Kb > 10-10 冰醋酸 Kb

36、 10-10 ~ 10-12 冰醋酸 + 醋酐 Kb HBr > H2SO4 > HCl > HSO > HNO3 生物堿氫鹵酸鹽: 加入醋酸汞的冰醋酸溶液 鹵化汞 排除干擾,,,非水溶液滴定法,3. 指示終點(diǎn)的方法: 電位法、指示劑法 指示劑的終點(diǎn)判斷需用電位法確定 結(jié)晶紫

37、 堿式色（紫） 酸式色（黃） （紫、藍(lán)紫、藍(lán)、藍(lán)綠、綠、黃綠、黃） 滴定較強(qiáng)堿 藍(lán)色 硫酸阿托品、氫溴酸東莨菪堿 堿性次之 藍(lán)綠色或綠色 二鹽酸奎寧、馬來酸麥角新堿 滴定較弱堿 黃綠或黃色 咖啡因,,非水溶液

38、滴定法,（三）應(yīng)用示例：1. 有機(jī)弱堿的測定: -----咖啡因的含量測定 溶劑: 醋酐-冰醋酸(5:1) 終點(diǎn)顏色: 黃色2. 生物堿鹽的測定: (1)氫鹵酸鹽: 加醋酸汞冰醋酸溶液(2)硫酸鹽: 滴定至硫酸氫鹽(3)硝酸鹽: 硝酸氧化性----破壞指示劑-----電位法指示終點(diǎn)(4)磷酸鹽與有機(jī)酸鹽: 直接滴定3. 制劑的測定: 非水

39、滴定法一般用于生物堿的原料藥的含量測定 制劑附加劑干擾, 需預(yù)處理。,二、提取酸堿滴定法,生物堿制劑 其它組分干擾 提取分離 滴定含生物堿的中藥及其制劑 為什么？ 怎么做？提取酸堿滴定法：利用生物堿及其鹽類的溶解性質(zhì)差異，經(jīng)堿化、有機(jī)溶劑提取后，再用酸堿滴定的容量分析

40、，適合于一些堿性較強(qiáng)（pKb =6~9）生物堿類藥物的分析。,,,,,,,,,,,,,（一）原理和方法,提取分離 滴定 第一步 第二步1. 堿化和提取分離 供試品 溶于水or稀礦酸 +堿性試劑 有機(jī)溶劑振搖提取 有機(jī)相水洗 脫水(無水硫酸

41、鈉or西黃蓍膠) 濾過 分得有機(jī)相,,,,,,,,,,,,,,,原理和方法,2. 滴定(1)定量過量酸溶: 有機(jī)溶劑蒸干 殘渣 定量過量酸滴定液溶 堿滴定液回滴 若生物堿易揮發(fā)or分解 有機(jī)溶劑蒸至近干 先加入酸滴定液“固定”生物堿 繼續(xù)加熱除去殘余的

42、有機(jī)溶劑 放冷后滴定(2)中性乙醇溶: 有機(jī)溶劑蒸干 殘渣 少量中性乙醇溶解 酸滴定液滴定 (3)直接酸提: 不蒸有機(jī)溶劑+ 定量過量的酸滴定液 振搖 生物堿轉(zhuǎn)入酸液中

43、 有機(jī)層水洗 合并 堿滴定液回滴 注: 有些生物堿(可待因、奎寧)鹽酸鹽溶于氯仿 氯仿為提取溶劑 酸滴定液不宜用鹽酸 ，應(yīng)選硫酸,,,,,,,,,,,,,,,,,（二）測定條件的選擇,堿化試劑提取溶劑指示劑的選擇乳化的預(yù)防和消除 （三）應(yīng)用

44、示例磷酸可待因的含量測定：祥見講義,1. 堿化試劑,氨水、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氧化鎂含酯結(jié)構(gòu)的藥物 分解含酚結(jié)構(gòu)的藥物 酚鹽 強(qiáng)堿不適于含脂肪性共存物的藥物 乳化氨水：常用的、理想的堿化試劑 （pKb =4.76），一般的生物堿的pKb =6~9 ，足以使大部分生物堿游離；不會產(chǎn)生分解和乳化作用；氨具有揮發(fā)性，易除去，消除

45、對測定的干擾。,,2. 提取溶劑,選擇原則:(1)應(yīng)選擇對生物堿具有極大的溶解度又與水不相混溶的，對其他物質(zhì)不溶或幾乎不溶的易揮發(fā)性有機(jī)溶劑。(2)所選擇的有機(jī)溶劑對生物堿及堿化試劑應(yīng)化學(xué)惰性。 （提取強(qiáng)生物堿時，不易用氯仿） 常用溶劑： 1. 氯仿: 最常用(除少數(shù)不溶于氯仿的生物堿如嗎啡及強(qiáng)堿性生物堿) 2. 乙醚 3. 氯仿+乙醚; 氯仿+醇 ; 二氯乙烷+二氯甲烷,3. 指示劑的選擇,生物堿

46、 強(qiáng)酸滴定 強(qiáng)酸弱堿鹽 終點(diǎn)溶液酸性 酸性區(qū)域指示劑,,,,4. 乳化的預(yù)防和消除,（1）預(yù)防：采用堿性弱的堿化試劑；選擇不易產(chǎn)生乳化的有機(jī)溶劑；在提取完全的前提下，盡量避免劇烈的振搖。（2）消除：?再加一些有機(jī)相或水相或放出已分層的有機(jī)相，

47、通過改變相體積比破壞乳化層的穩(wěn)定性。?加數(shù)滴乙醇并輕輕轉(zhuǎn)動分液漏斗。?用熱毛巾在分液漏斗外熱敷。?加入無機(jī)鹽破壞乳化。?用脫脂棉過濾。?將乳化層離心，用離心力幫助乳化層分層。,三、酸性染料比色法,生物堿 + 酸性染料 一定pH 定量結(jié)合顯色 測含量 （磺酸酞類） 方法的靈敏度較高，具一定的專屬性和準(zhǔn)確性 適合含量較低

48、的生物堿制劑的定量分析應(yīng)用示例：中國藥典硫酸阿托品片的含量測定；氫溴酸山莨菪堿的片劑和注射液的含量測定對照品溶液的制備；供試品溶液的制備；測定,,,,（一）原理和方法,BH+ + In– ??(BH+?In– )水相??(BH+?In– )有機(jī)相 酸性染料 離子對化合物（電中性） (溴百里酚藍(lán)、溴酚藍(lán)、溴甲酚紫、溴甲酚綠)

49、 定量提取 一定? ，測吸收度 或堿化，釋放酸性

50、 染料，測吸收度 計算含量,,,（二）問題的討論,提取化學(xué)平衡： BH+水相 + In–水相 (BH+?In– )有機(jī)相 k = 影響酸性染料比色

51、法的關(guān)鍵因素：介質(zhì)的pH值??酸性染料的性質(zhì)有機(jī)溶劑的性質(zhì),酸性染料比色法的影響因素,1. 水相pH值的選擇: B + H + ?? BH+ HIn ?? H+ + In- pH過低, 抑制酸性染料離解, In- 濃度太低, 影響離子對形成 pH過高, 生物堿呈游離狀態(tài), 不能形成離子對選擇一個最佳pH值 酸性染料比色法至關(guān)重要的實驗條件選擇方法:

52、根據(jù)生物堿和染料的pK值而定2. 酸性染料的種類: 選擇要求: 與生物堿定量結(jié)合; 生成的離子對在有機(jī)相中溶解度大; 在最大吸收波長處有較高的吸收度,,酸性染料比色法的影響因素,3. 有機(jī)溶劑的影響 有機(jī)溶劑與離子對形成氫鍵的能力強(qiáng) 提取效率高 氯仿、二氯甲烷 中等程度的提取率；選擇性好

53、 常用的有機(jī)溶劑4. 水分的 影響 ：嚴(yán)防水分的混入 原因：微量水分會使有機(jī)溶劑發(fā)生混濁，影響比色； 由水分帶入未反應(yīng)的染料，會使結(jié)果偏高。5. 共存物的影響：賦形劑，中性、酸性以及極弱堿性的物質(zhì)不干擾。 強(qiáng)酸可改變?nèi)玖先芤夯蚓彌_液的pH，對測定有干擾。,,,（三）應(yīng)用示例,中國藥典硫酸阿托品片的含量測定1. 對照品溶液的制備2. 供

54、試品溶液的制備 3. 測定法: 提取溶劑: 氯仿 酸性染料: 溴甲酚綠 測定波長: 420nm 計算中國藥典: 氫溴酸山莨菪堿的片劑、注射液,四、高效液相色譜法,高效液相色譜法在生物堿含量測定中應(yīng)用廣泛，近二十年報道的生物堿類藥物分析的文獻(xiàn)中，HPLC法的數(shù)目居首位，其中80%以上采用反相高效液相色譜法。反相高效液相色譜法反相離子對高效液相色譜法其它高效液相色譜法,（

55、一）反相高效液相色譜法,固定相：極性很弱，如ODS。流動相：極性較強(qiáng)，如水-甲醇、水-乙腈出峰順序：極性強(qiáng)的組分先出峰，極性弱的組分后出峰。適用情況：適合于共存組分極性差異較大樣品的分析。注意事項：防拖尾及保留時間過長 加入堿性試劑，使 pH為7~8左右 離子抑制HPLC 常用堿性試劑：二乙胺、三乙胺 例：中國藥典（2000

56、年版）甲磺酸二氫麥角堿片的含量測定,,,（二）反相離子對高效液相色譜法,離子對色譜法：將待測組分的反離子加入到流動相中，同呈離解狀態(tài)的藥物生成可逆的離子對化合物。分離生物堿類藥物主要采用烷基磺酸鹽（戊烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉）影響因素：pH值，反離子種類，流動相（ 流動相應(yīng)呈酸性）。例：USP（23）測定硫酸嗎啡和硫酸嗎啡注射液。 BP測定硫酸阿托品注射液含量祥見（P239）,（三）其它高效液相色譜方法,1.

57、 固定相： 硅膠柱 以極性有機(jī)溶劑和水的混合溶液為流動相 （分離機(jī)理 離子交換色譜） 堿性藥物離解，正離子與硅膠表面硅醇基上的H+交換。保留時間與藥物的堿性有關(guān)，而與脂溶性關(guān)系不大，藥物堿性越強(qiáng)，離解的比例越大，保留時間越長。流動相中加入一定量的醋酸銨，NH4+為競爭離子，與質(zhì)子化的藥物競爭硅膠表面的離子交換部位，起調(diào)節(jié)保留時間和改善分離

58、的作用。,,,其它高效液相色譜方法,2. 固定相：金剛烷基硅烷化硅膠 金剛烷(C10H16) 剛性分子結(jié)構(gòu)(體積大) 掩蔽周圍硅膠表面的游離硅醇基 改善分離3. 固定相：ODS；流動相加入掃尾劑（三乙胺） 掃尾劑：抑制或掩蔽固定相表面游離硅醇基的活性，使堿性藥物易于出峰，且峰形對稱。,,,,五、氣相色譜法,生物堿的游離堿 直接GC分析

59、生物堿的鹽 約325°C的急速加熱器中 解離 游離生物堿 酸 （對色譜柱和檢測器有不良影響） 生物堿鹽的水溶液鹽應(yīng)先堿化 有機(jī)溶劑提取 游離堿例：硫酸阿托品片劑的含量測定[USP(23