藥物分析藥物分析方法

1、3.5,藥 物 分 析 方 法,藥物分析方法,核磁、質(zhì)譜等技術(shù),,,,,一、常規(guī)的化學(xué)分析法,1. 容量（滴定）分析法 將一種標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到待測(cè)物質(zhì)的溶液中，直到與待測(cè)物質(zhì)按化學(xué)計(jì)量關(guān)系定量反應(yīng)為止，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和所消耗的體積，計(jì)算待測(cè)物質(zhì)含量的方法。,基本術(shù)語(yǔ),滴定：將滴定劑通過(guò)滴管滴入待測(cè)溶液中的過(guò)程。滴定劑（標(biāo)準(zhǔn)溶液）：濃度準(zhǔn)確已知的溶液。指示劑：滴定分析中能發(fā)生顏色改變而指示終點(diǎn)的試劑。,滴定

2、終點(diǎn)：滴定分析中指示劑發(fā)生顏色改變的那一點(diǎn)。,2、 滴定分析法的分類,A）按化學(xué)反應(yīng)類型分類酸堿滴定法：質(zhì)子轉(zhuǎn)移絡(luò)合滴定法：生成絡(luò)合物氧化還原滴定法：電子轉(zhuǎn)移沉淀滴定法：生成沉淀,滴定操作,2、 滴定分析法的分類,B）按滴定方式分類直接滴定：標(biāo)液滴定待測(cè)物，直到所滴加的試劑與待測(cè)物質(zhì)按化學(xué)計(jì)量關(guān)系定量反應(yīng)為止。返滴定法：先用過(guò)量標(biāo)準(zhǔn)溶液A與待測(cè)物反應(yīng)后，再用另一種標(biāo)準(zhǔn)溶液B滴定剩余的A溶液。置換滴定： 先用適當(dāng)試劑與待測(cè)物

3、質(zhì)反應(yīng)，定量置換出另一種物質(zhì)，再用標(biāo)準(zhǔn)溶液去滴定該物質(zhì)的方法。,,滴定分析對(duì)化學(xué)反應(yīng)的要求：a.反應(yīng)定量、完全b.反應(yīng)迅速c.具有合適的確定終點(diǎn)的方法特點(diǎn)： 簡(jiǎn)便、快速；適于常量分析；準(zhǔn)確度高； 應(yīng)用廣泛。,Ch.P（2005）中采用的滴定分析法：,酸堿滴定、 銀量法、 碘量法、 亞硝酸鈉滴定法、 配位滴定法、 雙相滴定法、 高錳

4、酸鉀滴定法、 溴酸鉀滴定法、 碘酸鉀滴定法、 高碘酸鉀滴定法等。,2.重量分析法,重量分析法，是將被測(cè)組分與試樣中的其他組分分離后，轉(zhuǎn)化成一定的稱重形式，然后用稱重方法測(cè)定該組分的含量。重量分析法的分類揮發(fā)重量法 用加熱等方法將待測(cè)物中揮發(fā)性成分揮發(fā)后，稱量殘?jiān)?，由樣品減少的量來(lái)計(jì)算該揮發(fā)組分的量。常用來(lái)測(cè)定物料的水分、揮發(fā)分和灰分。,應(yīng)用,例如： 氯化鋇中結(jié)晶水含量的測(cè)定 水分在試樣中存在的形式：

5、吸附水，結(jié)晶吸附水：在105~110 ℃烘干結(jié)晶水：根據(jù)具體的物質(zhì)決定，例如 BaCl2·2H2O可以在120~125 ℃烘干。,,萃取重量法 溶劑萃取待測(cè)物后，將萃取液蒸干，稱量干燥物重量。Ch.P（2005）中收載苯妥英鈉的含量測(cè)定就是利用萃取重量法。（P40~41）,,沉淀重量法 利用沉淀反應(yīng)，將待測(cè)物轉(zhuǎn)化為沉淀，分離并稱定其重量。,沉淀重量法的應(yīng)用,,濾，洗灼燒，800℃,,

6、SO42- + BaCl2 BaSO4 BaSO4,,濾，洗灼燒,,Fe3+ + NH3·H2O Fe(OH)3 Fe2O3,Ch.P（2005）中收

7、載甲磺酸酚妥拉明的含量測(cè)定。P41,儀器分析法,色譜分析色譜法溯源俄國(guó)科學(xué)加1903年發(fā)現(xiàn)色譜的吸附原理，開(kāi)創(chuàng)了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法并見(jiàn)諸于俄文的文獻(xiàn)1906年正式命名（見(jiàn)諸文獻(xiàn)）色譜法；Chromatography50年代開(kāi)始廣泛研究和應(yīng)用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于70年代,色譜的分類,氣相色譜：流動(dòng)相是氣相液相色譜：流動(dòng)相是液相,高效液相色譜,High Performance L

8、iquid Chromatography高效液相色譜法，簡(jiǎn)稱：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測(cè)器……廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域：醫(yī)藥 / 環(huán)保 / 石化 / 生命科學(xué) / 食品及農(nóng)業(yè)……,,,,,液相色譜的基本流程圖,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,流動(dòng)相,泵,色譜柱,檢測(cè)器,,,,,,,,,進(jìn)樣閥,泵輸液,分離,檢測(cè),記錄,進(jìn)樣,HPL

9、C的儀器配置,高壓輸液泵,自動(dòng)進(jìn)樣器,色譜柱及柱溫箱,檢測(cè)器,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),流動(dòng)相,色譜圖：HPLC圖形結(jié)果,色譜圖即色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間。,← 色譜峰,保留時(shí)間（分）,基線↓,,,峰高,,,峰寬,響應(yīng)值,液相色譜應(yīng)用：分析型液相色譜,定量分析主要基于與標(biāo)準(zhǔn)品的比較是其最大應(yīng)用領(lǐng)域定性分析：基于樣品的保留時(shí)間比較借助于和其聯(lián)用的紫外、質(zhì)譜或其他檢測(cè)器對(duì)定

10、量及定性分析的要求靈敏度、精度及準(zhǔn)確度的要求樣品量的要求；復(fù)雜樣品的分析能力容易使用,HPLC在藥物分析中的應(yīng)用,常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等?？咕仡愃幬镅芯恐械膽?yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿、甙類(皂甙、強(qiáng)心甙、黃酮甙等)、萜類手性藥物研究中的應(yīng)用：光學(xué)異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強(qiáng))藥物

11、的檢測(cè)、新藥研究、藥物代謝、藥代動(dòng)力學(xué)研究。HPLC應(yīng)用示例P55,氣相色譜法,基本原理 GC是以惰性氣體作為流動(dòng)相，利用試樣中各組分在色譜柱中的氣相和固定相間的分配系數(shù)不同，實(shí)現(xiàn)分離的目的。當(dāng)汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱中運(yùn)行時(shí)，組分就在其中的兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配（吸附－脫附－放出）。由于固定相對(duì)各種組分的吸附能力不同（即保存作用不同），各組分在色譜柱中的運(yùn)行速度就不同，經(jīng)過(guò)一定的柱長(zhǎng)后，便彼此分離，順序離開(kāi)色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器

12、，產(chǎn)生的離子流信號(hào)經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰 。,氣相色譜儀,,,,,氣相色譜儀通常由五部分組成：Ⅰ 載氣系統(tǒng)：氣源、氣體凈化器、供氣控制閥門(mén)和儀表。Ⅱ 進(jìn)樣系統(tǒng)：進(jìn)樣器、汽化室。Ⅲ 分離系統(tǒng)：色譜柱、控溫柱箱。 Ⅳ 檢測(cè)系統(tǒng)：檢測(cè)器、檢測(cè)室。Ⅴ記錄系統(tǒng)：放大器、記錄儀、色譜工作站。,氣相色譜結(jié)構(gòu)流程,1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計(jì); 6-壓力表；7-進(jìn)樣器；8-色譜柱；9

13、-熱導(dǎo)檢測(cè)器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；,載氣系統(tǒng),進(jìn)樣系統(tǒng),色譜柱,檢測(cè)系統(tǒng),溫控系統(tǒng),,,,,,,應(yīng)用舉例,定量分析：a. 色譜峰的測(cè)量:以峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)的聯(lián)線作為峰底。從峰高極大值對(duì)時(shí)間鈾作垂線，對(duì)應(yīng)的時(shí)即為保留時(shí)間。從峰頂至峰底間的線段即為峰高。b. 計(jì)算:由色譜峰量出各組分的峰高，然后在各自的校準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的待測(cè)物濃度。定性結(jié)果： 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)譜圖各組分的保留時(shí)間確定被測(cè)試樣中出現(xiàn)的組分?jǐn)?shù)目和

14、組分名稱。,苯系物氣相色譜圖,平面色譜,在平面上進(jìn)行分離的一種色譜方法，主要包括薄層色譜法和紙色譜法。,分類薄層色譜法：吸附薄層色譜法 分配薄層色譜法 分子排阻薄層色譜法 紙色譜法：分配薄層電泳法,定性參數(shù),比移值(Rf值)溶質(zhì)移動(dòng)距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離之比。Rf =L/L0 L為原點(diǎn)（origin）至斑點(diǎn)中心的距離，L0為原點(diǎn)至溶劑前沿（solvent front）的距離 與組分及色譜條

15、件有關(guān),薄層色譜法,固定相（吸附劑或載體）涂布成一均勻薄層，點(diǎn)樣，（密閉的容器中）展開(kāi)，斑點(diǎn)顯色，（與對(duì)照物質(zhì)）比較進(jìn)行定性定量。操作步驟：制板（均勻） →點(diǎn)樣（集中） →展開(kāi)　(多種方式) →顯色（紫外燈或顯色劑）,(thin layer chromatography；TLC),定性和定量分析,定性分析 比較Rf值、斑點(diǎn)顏色或熒光常采用已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照（同一板上展開(kāi)）多種展開(kāi)系統(tǒng)的Rf值與對(duì)照品一致。定量分析　洗脫

16、法直接定量法　　　　1.目視比較法（如雜質(zhì)限度檢查方法）　　　　2.薄層掃描法,應(yīng)用示例,中藥中化學(xué)成分的分析例1，如右上圖，不同產(chǎn)地的甘草的TLC圖譜。,例2，某中藥的TLC圖譜與HPLC圖譜對(duì)照。,光譜分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通過(guò)測(cè)量物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行分析的方法。,,吸收光譜分析發(fā)射光譜分析分子光譜分析原子光譜分析,光譜分析,在光譜分析中，依據(jù)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)

17、的分析方法稱為吸光光度法,主要有: 紅外吸收光譜：分子振動(dòng)光譜，吸收光波長(zhǎng)范圍2.5?1000 ?m ,主要用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。 紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長(zhǎng)范圍200?400 nm（近紫外區(qū)） ，可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。 可見(jiàn)吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長(zhǎng)范圍400?750 nm ，主要用于有色物質(zhì)的定量分析。,紫外-可見(jiàn)分光光度法(ultraviolet-visible

18、 spectrophotometry, UV-VIS),它是利用物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外-可見(jiàn)光的吸收作用，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析、定量分析及結(jié)構(gòu)分析, 所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長(zhǎng)的光而產(chǎn)生的吸收光譜，即為紫外光譜。,紫外光譜的表示法,紫外光譜圖是由橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)和吸收曲線組成的。,橫坐標(biāo)表示吸收光的波長(zhǎng)，用nm（納米）為單位。 縱坐標(biāo)表示吸收光的吸收強(qiáng)度，可以用A(吸光度)、T(透光率)、1-T(吸收率)中的任何一

19、個(gè)來(lái)表示。 吸收曲線表示化合物的紫外吸收情況。 曲線最大吸收峰的橫坐標(biāo)為最大吸收波長(zhǎng)。,對(duì)甲苯乙酮的紫外光譜圖,在藥物分析中的應(yīng)用,UV-Vis分光光度法主要用于藥物的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定中。應(yīng)用一：藥品的鑒別測(cè)定最大吸收波長(zhǎng) 例如三唑侖，用無(wú)水乙醇制成每1ml中含5μg的溶液，照分光光度法測(cè)定，在221nm處有最大吸收。測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)和最小吸收波長(zhǎng) 如五氟利多測(cè)定最大波長(zhǎng)和不同波長(zhǎng)的吸收值比值測(cè)定吸

20、收系數(shù),例: 在頭孢類抗生素中，常在性狀項(xiàng)下規(guī)定吸收系數(shù)，以控制藥品的質(zhì)量。,應(yīng)用二：藥品的雜質(zhì)檢查,用分光光度法對(duì)藥品中的特殊雜質(zhì)進(jìn)行檢查，可將雜質(zhì)用適當(dāng)?shù)娜軇┨崛?，與主成分分離后測(cè)定，還可用雜質(zhì)的顯色反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。 如維生素B2中感光黃素的檢查 取本品25mg，加無(wú)乙醇氯仿10ml，振搖5min，濾過(guò)，濾液照分光光度法，在440nm處測(cè)定，吸收度不得過(guò)0.016。,應(yīng)用三：藥品的含量測(cè)定,UV-Vis分光光度

21、法簡(jiǎn)便，快速，在藥物的含量測(cè)定中應(yīng)用廣泛。 含量測(cè)定時(shí)通常選擇最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定供試品的吸收度，用對(duì)照品或百分吸收系數(shù)（ ）計(jì)算藥品的含量。如藥典中 乙胺嘧啶片的含量測(cè)定 P70,紅外光譜法,藥物受到紅外區(qū)電磁波的輻射，激發(fā)分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的變化，產(chǎn)生紅外吸收光譜。有機(jī)分子中的許多官能團(tuán)具有特征的振動(dòng)能級(jí)，相應(yīng)于IR光譜一定區(qū)域的特征吸收帶，可用于鑒別這些官能團(tuán)。此外，有大量的標(biāo)準(zhǔn)光譜和數(shù)據(jù)庫(kù)可資比較，常?？梢詫?duì)

22、藥物結(jié)果作出確切的鑒定。,紅外光譜分析的應(yīng)用,在藥物分析中，紅外光譜主要用于定性鑒別。 定性鑒別時(shí)，主要著眼于供試品光譜與對(duì)照光譜全譜譜形的比較，即首先是譜帶的有與無(wú)，然后是各譜帶的相對(duì)強(qiáng)弱。,若供試品的光譜圖與對(duì)照光譜圖一致，通?？膳卸▋苫衔餅橥晃镔|(zhì)（除光學(xué)異構(gòu)體）。若兩光譜不同，則可判定兩化合物不同。,示例1：紅外光譜鑒別青霉素類藥物P78示例2：芐醇的紅外光譜,質(zhì)譜分析,質(zhì)譜法是一種按照離子的質(zhì)核比（m/

23、z）大小對(duì)離子進(jìn)行分離和測(cè)定的方法。分析時(shí)，首先將分子離子化，然后利用離子在電場(chǎng)或磁場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)的性質(zhì)，把離子按質(zhì)核比大小排列成譜，此即為質(zhì)譜。質(zhì)譜法的主要作用是：（1）準(zhǔn)確測(cè)定物質(zhì)的分子量（2）根據(jù)碎片特征進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)分析,質(zhì)譜分析過(guò)程和原理,質(zhì)譜法分類,進(jìn)樣系統(tǒng)(inlet system) 離子源(ion source)質(zhì)量分析器（mass analyzer）檢測(cè)器（detecter） 真空系統(tǒng)（Vacuu

24、m system）,質(zhì)譜儀的組成,1.氣體擴(kuò)散2.直接進(jìn)樣3.氣相色譜,1.電子轟擊2.化學(xué)電離3.場(chǎng)致電離4.激光,1.單聚焦 2.雙聚焦 3.飛行時(shí)間4.四極桿,離子源的真空度應(yīng)達(dá)到10-3-10-5 Pa，質(zhì)量分析器應(yīng)達(dá)到10-6 Pa。,有機(jī)質(zhì)譜譜圖及信息表達(dá),二氯甲烷的電子轟擊質(zhì)譜,色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為一種高效的定性定量分析工具。中藥未知成分的鑒定，LC-MS測(cè)定雷公藤的化

25、學(xué)組分揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析藥物代謝研究，液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜法檢測(cè)體液中士的寧、馬錢(qián)子堿及其主要代謝物。,質(zhì)譜在藥物分析結(jié)構(gòu)鑒定中起著重要的作用，主要用于判定藥物的分子量和分子式。,電化學(xué)分析法,電化學(xué)分析是根據(jù)電化學(xué)原理建立起來(lái)的一類分析方法。 電化學(xué)分析法主要是應(yīng)用電化學(xué)的基本原理和技術(shù)，研究在化學(xué)電池內(nèi)發(fā)生的特定現(xiàn)象，利用物質(zhì)的組成及含量與它的電化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系而建立起來(lái)的一類分析方法。,定性和定量分析依據(jù),分

26、析方法：設(shè)計(jì)電池，使得試樣溶液成為電化學(xué)電池的組成部分，然后測(cè)量電池的某些參數(shù)（電壓、電流、電阻、電量等），或根據(jù)這些參數(shù)的變化來(lái)進(jìn)行待測(cè)組分的定量或定性分析?；驹?利用電池電動(dòng)勢(shì)與試液中離子活度之間一定的數(shù)量關(guān)系，從而測(cè)得離子的活度。,,電化學(xué)分析法分類 電位分析法 庫(kù)侖分析法 極譜分析法 電導(dǎo)分析法 電解分析法電位分析法特點(diǎn) 靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確度都較高

27、 被分析物質(zhì)的最低量接近10-12mol數(shù)量級(jí)。,電化學(xué)方法的應(yīng)用,電位滴定法是藥物分析中應(yīng)用最多的電化學(xué)方法電位滴定法實(shí)際是用電位法指示滴定分析終點(diǎn)的方法。即在滴定液中加入指示電極和參比電極，由滴定過(guò)程中指示電極的電位突躍來(lái)指示終點(diǎn)。,示例,例1.泛影酸的含量測(cè)定,Ch.P(2005)曙紅鈉為指示劑，BP采用電位法指示終點(diǎn)。,例2.電位滴定法測(cè)定復(fù)方氯丙那林魚(yú)腥草素鈉片中魚(yú)腥草素鈉的含量。P90,,,多維色譜分析技術(shù)新型

28、色譜技術(shù)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)微流控芯片和生物芯片分析技術(shù),現(xiàn)代分析新技術(shù),,藥物分析方法的發(fā)展趨勢(shì),從經(jīng)典的化學(xué)分析方法向儀器分析方法轉(zhuǎn)變。儀器分析的特點(diǎn):（1） 樣品適用性廣，特別適用于微量、痕量組分含量分析（含量<1%，測(cè)量的相對(duì)誤差為1~10%）（2） 適合于復(fù)雜體系的分析分離（3）操作簡(jiǎn)便快速（4）最適用于生產(chǎn)過(guò)程中的控制分析。,,,儀器分析的發(fā)展趨勢(shì)： 方便、快捷；多功能；環(huán)保、經(jīng)濟(jì)；高質(zhì)量（準(zhǔn)確度