生物藥物分析與檢測抗生素藥物分析

1、,（二）抗生素質量的復雜性 1、化學純度較低。同系物多；異構體多；降解物多。 2、活性成分易發(fā)生變異。生產工藝復雜，發(fā)酵過程不易控制，易受污染。 3、產品穩(wěn)定性差。分子結構大多不穩(wěn)定，降解后療效下降、失效或增加毒副作用。,第一節(jié) 概 述,一、抗生素藥物的特點,,,（一）鑒別試驗 1．官能團的顯色反應 如β－內酰胺類的羥肟酸鐵反應、氨基糖苷類的麥

2、芽酚反應等。 2．光譜法 包括紫外吸收光譜和紅外吸收光譜。 3．色譜法 包括高效液相色譜和薄層色譜。 4．生物學法 檢查抗生素的抗菌能力。,第一節(jié) 概 述,二、抗生素藥物的質量分析,,＊,,（二）檢查 1．影響產品穩(wěn)定性的指標 包括晶型、水分、pH等。 2．控制有機和無機雜質的指標 包括澄清度與顏色、有關物質、殘留溶劑、熾灼

3、殘渣、重金屬等。 3．與臨床安全性密切相關的指標 包括異常毒性、熱原、細菌或內毒素、降壓物質、無菌等。 4．其他指標 對多組分抗生素進行組分分析等。,第一節(jié) 概 述,二、抗生素藥物的質量分析,,,（三）含量測定或效價測定 1．微生物檢定法：以抗生素對微生物的殺傷或抑制程度為指標來衡量抗生素效價的一種方法。具有測定結果與臨床效果一致、靈敏度高、干擾物質少等特點

4、。但也存在操作繁瑣、培養(yǎng)時間長、測定誤差大等缺點。 2．理化方法：根據(jù)抗生素的分子結構特點，利用其特有的化學或物理化學及反應而進行的。理化方法優(yōu)點是準確度高、操作簡便、快速，但其含量不一定代表生物效價，測定方法易受雜質干擾等問題。,第一節(jié) 概 述,二、抗生素藥物的質量分析,,,1．β-內酰胺類：主要包括青霉素類和頭孢菌素類等。 2．氨基糖苷類：包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素

5、、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素等。 3．四環(huán)素類：包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等。 4．氯霉素類：包括氯霉素、甲砜霉素等。 5．大環(huán)內脂類：臨床常用的有紅霉素、白霉素、無味紅霉素、乙酰螺旋霉素、麥迪霉素、交沙霉素等。 6．其它：如作用于G+細菌的其它抗生素：如林可霉素、氯林可霉素、萬古霉素、桿菌肽等；,第一節(jié) 概 述,三、抗生素的分類,,,（一）化學結構

6、 青霉素類的分子結構是由母核6-氨基青霉烷酸（6-APA）和側鏈RCO-兩部分結合而成。孢菌素類的分子結構是由母核6-氨基頭孢烷酸（7-ACA）和側鏈RCO-兩部分結合而成。,第二節(jié) β-內酰胺類抗生素,一、化學結構與性質,,,（二）性質 1．酸性 青霉素類和頭孢菌素類結構中有游離的羧基，具有較強的酸性，pKa值在2.5~2.8之間，能與無機堿或某些有機堿成鹽，如青

7、霉素G鈉、青霉素G鉀等。 2．旋光性 青霉素類（3個手性碳原子）和頭孢菌素類結構中都有手性碳原子（2個），都具有旋光性。,第二節(jié) β-內酰胺類抗生素,一、化學結構與性質,,,（二）性質 3．紫外吸收 青霉素類母核沒有共軛系統(tǒng)，沒有紫外吸收，但青霉素類藥物在弱酸性下水解，可以產生具有共軛雙鍵的青霉烯酸，在紫外光區(qū)有吸收。側鏈中有苯環(huán)等取代基的藥物

8、，在紫外光區(qū)也有吸收。像芐青霉素。頭孢菌素類分子中有共軛體系（O＝C－N－C＝C）在波長260nm處有最大吸收。,第二節(jié) β-內酰胺類抗生素,一、化學結構與性質,,（二）性質 4. ?-內酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性 干燥、純凈青霉素類抗生素穩(wěn)定，其水溶液很不穩(wěn)定不穩(wěn)定的部分是?-內酰胺環(huán)。 ?-內酰胺環(huán)在酸、堿、青霉素酶、某些金屬離子的作用下，可使?-內酰胺環(huán)開環(huán)或發(fā)生分子重排，而失去抗菌作用，形

9、成一系列降解產物。,第二節(jié) β-內酰胺類抗生素,一、化學結構與性質,,,（一）呈色反應 1．羥肟酸鐵反應 青霉素和頭孢菌素在堿性條件下與鹽酸羥胺作用，?-內酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸，在稀酸中與高鐵離子顯色。 2．類似肽鍵的反應 青霉素和頭孢菌素均具有-CONH-結構，一些取代基有α-氨基結構，可顯茚三酮反應和雙縮脲反應。,第二節(jié) β-內酰胺類抗生素,

10、二、鑒別試驗,,,（一）呈色反應 3．其它呈色反應 （1）與重氮苯磺酸反應 頭孢哌酮結構中含有酚羥基，可與重氮苯磺酸發(fā)生偶合反應而顯色。 （2）與變色酸-硫酸反應 青霉素類藥物中，如阿莫西林、氨芐西林等結構中有活潑“-CH2-”經硫酸加熱分解生成的甲醛與變色酸反應而呈色。,第二節(jié) β-內酰胺類抗生素,二、鑒別試驗,,（二）各種鹽的反應

11、 K+、Na+的火焰反應 青霉素和頭孢菌素類藥物多制成鈉鹽或鉀鹽使用，可利用火焰反應進行鑒別。 （三）光譜法 1．紅外光譜法 β－內酰胺環(huán)上的羰基伸縮振動增強而向高波數(shù)方向位移，仲酰胺的氨基、羰基伸縮振動，羧基離子伸縮振動是本類藥物的特征峰。 2．紫外光譜法 通常利用最大吸收波長進行鑒別。,第二節(jié) β-內酰胺

12、類抗生素,二、鑒別試驗,,（一）聚合物 聚合物的定量方法：一般用于SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中β-內酰胺抗生素中高分子雜質的檢查。在該分離系統(tǒng)中，除部分寡聚物外，β-內酰胺抗生素中高分子雜質在色譜過程中均不保留，即所有的高分子雜質表現(xiàn)為單一的色譜峰，以藥物自身為對照品，按外標法計算藥品中高分子雜質的相對百分含量。,第二節(jié) β-內酰胺類抗生素,三、特殊雜質的檢查,,垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質

13、由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落后于大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應。,,（二）有關物質和異構體

14、 通常采用色譜法（HPLC法等）檢查β-內酰胺類抗生素中的有關物質和異構體。 （三）雜質吸光度 藥典常采用測定雜質吸光度的方法來控制本類抗生素的雜質含量。 例如：將青霉素鈉（鉀）配成1.80mg·ml-1的溶液，在波長280nm處的A≤0.10（控制雜質量）；在波長264nm處的A為0.80～0.88（檢查藥物量）。,第二節(jié) β-內酰胺類抗生素,三、特殊雜

15、質的檢查,,HPLC法具有快速、高效、靈敏、專屬性強、重現(xiàn)性好等特點，在本類藥的含量中應用越來廣泛。 多數(shù)采用反向HPLC測定，以外標法計算含量。 如氨芐西林原料藥含量測定：取本品約25mg，精密稱定，置25ml容量瓶中，加稀釋液適量，超聲處理使溶解后，再用上述稀釋液稀釋至刻度，搖勻，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取氨芐西林對照品25mg，同法測定。按外標法以峰面積計算供試品

16、中氨芐西林（C16H19N3O4S）的含量。,第二節(jié) β-內酰胺類抗生素,四、含量測定,,（一）化學結構 鏈霉素的結構是由鏈霉胍和鏈霉糖、 N-甲基-L-葡萄糖胺結合而成的堿性苷。,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,一、化學結構與性質,,（一）化學結構 慶大霉素是由紫素胺和脫氧鏈霉胺、N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺結合而成的苷。它是由三個類似結構的C1、C2、C1a組成的混合物。

17、,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,一、化學結構與性質,C1：R1=R2=CH3 ; C2：R1=CH3, R2=H ; C1a：R1=R2=H, R3=H,,（二）性質 1．堿性與溶解性：由于結構中含有多個羥基和堿性基團。 2．旋光性：本類藥物結構中有多個氨基糖，具有旋光性。如硫酸慶大霉素的比旋度為+107?！?121。 3．穩(wěn)定性：硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素干燥品比較穩(wěn)定，硫酸鏈霉素水溶液在pH

18、5～7.5最穩(wěn)定，硫酸慶大霉素在pH2～12比較穩(wěn)定。 4．UV：鏈霉素λmax=230nm，慶大霉素無共軛雙鍵，因此無紫外吸收。,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,一、化學結構與性質,,（一）茚三酮反應 本類藥物具有羥基胺結構和α-氨基，可與茚三酮縮合，生成藍紫色化合物。 取慶大霉素5mg，加水1ml，0.1%茚三酮的水飽和正丁醇溶液1ml，吡啶0.5ml，水浴加熱5min，顯紫色。

19、（二）Molisch試驗 具有五碳糖或六碳糖結構的氨基糖苷類抗生素經酸水解后，在鹽酸或硫酸作用下脫水，成糠醛（五碳）或羥甲基糠醛（六碳糖）。這些產物遇a-萘酚或蒽酮成色。,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,二、鑒別試驗,,（三）N-甲基葡萄糖胺反應（Elson-Morgan反應） 鏈霉素水解產物N-甲基葡萄糖胺在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，與二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反應，即生成紅色化合物。

20、 （四）麥芽酚（Maltol）反應 鏈霉素在堿性溶液中，鏈酶糖經分子重排，消除N—甲基葡萄糖胺及鏈酶胍，生成麥牙酚，麥牙酚可與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,二、鑒別試驗,,（五）坂口反應 本品水溶液，加氫氧化鈉試液，水解為鏈酶胍，與8—羥基喹啉作用，再加次溴酸鈉試液，生成橙紅色化合物。 （六）硫酸鹽反應 本類藥物多為硫

21、酸鹽，可利用硫酸鹽與氯化鋇試液生成白色硫酸鋇沉淀進行鑒別。,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,二、鑒別試驗,,（七） TLC法 中國藥典2005版采用該法對硫酸慶大霉素進行鑒別。方法：取供試品溶液和對照品溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，用氯仿-甲醇-氨水（1:1:1）的下層混合液為展開劑，展開后，晾干，置碘蒸氣中顯色，供試品溶液和對照品溶液所顯斑點的顏色和位置應一致。（八）光譜法 采用紅外光譜

22、法可鑒別慶大霉素。慶大霉素無紫外吸收，而鏈霉素可采用紫外法鑒別，λmax=230nm。,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,二、鑒別試驗,,取本品適量，精密稱定，加水制成含0.65mg·ml-1的溶液，取4ml置10ml容量瓶中，加異丙醇2ml與鄰苯二醛試液1.6ml，用異丙醇稀釋至刻度，搖勻，置60℃水浴中加熱15min，冷卻，濾過，量取濾液10μl注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。另取慶大霉素標準品，同法測定。C組分的保留時間依

23、次為：C1、C1α、C2α、C2。量取C1、C1α、C2α、C2的峰高，按峰面積歸一化法計算：,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,三、特殊雜質檢查及組分分析,規(guī)定：C1 應為25~50%，C1a應為15~40%，C2a +C2應為20~50%。,,目前各國藥典均采用微生物檢定法測定本類藥物的效價。本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用量反應平行線原理的設計，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法

24、。,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,四、含量測定,,（一）化學結構 四環(huán)素類抗生素具有十二氫化并四苯基本結構，屬于廣譜抗菌藥物。,第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素,一、化學結構與性質,,（二）性質 1．酸堿性與溶解度 本類抗生素結構中含有酚羥基、烯醇型羥基，顯弱酸性，而二甲胺基又顯弱堿性，故四環(huán)素類抗生素是兩性化合物。與酸、堿均能成鹽。 2．旋光性 四環(huán)素類抗生素分

25、子結構中具有不對稱碳原子，有旋光性，可用于定性、定量分析。,第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素,一、化學結構與性質,,（二）性質 3．紫外吸收和熒光性質 四環(huán)素類抗生素分子結構中具有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外區(qū)有吸收，在紫外照射下可產生熒光，它們的降解產物也具有熒光。 4．與金屬離子絡合 與金屬離子Ca2+ 、Mg2+、Fe3+、Al3+生成有色配位化合物，并在pH3 ~ 7.5產生熒光。,

26、第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素,一、化學結構與性質,,（二）性質 5．不穩(wěn)定性 （1）差向異構化 弱酸性（pH2.0~6.0）溶液中，A環(huán)上手性C4構型的改變，發(fā)生差向異構化，形成差向四環(huán)素。 四環(huán)素和金霉素很易差向異構化，形成4-差向四環(huán)素、4-差向金霉素，他們的抗菌性極弱或完全消失。土霉素和強力霉素由于C5上的羥基和二甲胺基形成氫鍵，不易發(fā)生差向異構化。,第四節(jié) 四環(huán)

27、素類抗生素,一、化學結構與性質,,（二）性質 5．不穩(wěn)定性 （2）酸性降解反應 在酸性（pH<2）時，C環(huán)上C6上羥基易脫落與C5a上的氫生成水，在C6-C5a間形成雙鍵。經重排使C環(huán)芳構化，生成脫水四環(huán)素類。（3）堿性降解反應： 在堿性下，C環(huán)打開，生成無活性的具有內酯結構的異四環(huán)素；若強堿性下加熱，可定量地轉化為異四環(huán)素，后者具有強烈熒光，可熒光法測定。,第四節(jié)

28、 四環(huán)素類抗生素,一、化學結構與性質,,（一）呈色反應 四環(huán)素類抗生素遇H2SO4 、FeCl3均產生不同的顏色。,第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素,二、鑒別試驗,（二）色譜法 HPLC、 TLC法可用于四環(huán)素類抗生素鑒別，中國藥典（2005版）均有收載。 （三）光譜法 IR光譜法、UV光譜法也可四環(huán)素類抗生素鑒別，中國藥典（2005版）均有收載。,,（一）有關物質