超聲分子影像顯像胰島移植IBMIR.pdf

1、背景:
　　 IBMIR是以凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng)激活,中性粒單核細胞浸潤為特征的級聯(lián)反應,導致胰島被破壞。其發(fā)生以血小板活化為放大劑,為我們從凝血系統(tǒng)活化角度識別IBMIR發(fā)生程度和范圍提供了理論依據(jù)。分子影像學的發(fā)展,使得影像學從觀察大體解剖變化向觀察微觀分子水平的復雜病理學變化方面轉變。超聲的靈敏度極高,具有成像簡便、快速、實時、可重復等優(yōu)點,為我們采用超聲分子影像技術顯示IBMIR發(fā)生提供了可能。
　　 目的:

2、>　　 通過制備靶向結合活化血小板的靶向超聲造影劑,建立體內(nèi)外IBMIR模型,采用超聲造影及其強度定量分析軟件評價靶向超聲造影劑顯示胰島移植IBMIR的能力和效果,實現(xiàn)胰島移植IBMIR的超聲分子成像特異性顯像。
　　 方法:
　　 一、血栓靶向脂質超聲造影劑的制備與鑒定
　　 首先合成熒光標記的能與血小板糖蛋白GPⅡ b/Ⅲa受體特異性結合的KGDS-棕櫚酸化合物。采用“超聲勻化+高速機械剪切”法,以FITC

3、-KGDS-Palm為主要原料之一,制備靶向脂質超聲造影劑。顯微鏡觀察靶向微泡的形態(tài)及分布;馬爾文顆粒計數(shù)儀檢測微泡大小、濃度及分布;熒光顯微鏡觀察KGDS多肽與微泡結合情況;流式細胞儀評價多肽與微泡的結合效率;觀察靶向微泡在體內(nèi)外的穩(wěn)定性;采用體內(nèi)外血栓模型,檢測靶向微泡與血栓特異性結合的能力。
　　 二、體外IBMIR模型的建立
　　 將500 IEQ和1000 IEQ新生豬胰島分別與實驗組人的7ml新鮮全血混合加入

4、肝素化的管道,使Loops管內(nèi)新鮮血液中肝素的最終濃度分別為0.001mg/ml、0.01 mg/ml、0.02 mg/ml。Loops管固定于鐘擺式無級調(diào)節(jié)溫控搖床中搖擺5分鐘、10分鐘、60分鐘,模擬血液在體內(nèi)血管的流動?？瞻捉M健康人新鮮全血抽出后立即作檢測,對照組健康人新鮮全血7ml+100μl培養(yǎng)液,搖擺60min。檢測血液中BR、C3a、C5b-9、ATA、β-TG等的變化,稱重凝血塊的重量并對其行病理學檢測。
　　

5、三、體外IBMIR的超聲分子成像
　　 體外IBMIR模型(7ml新鮮全血+1000IEQ新生豬胰島)超聲分子成像實驗分為三組,均重復3次:A組為對照組,不加造影劑;B組為普通超聲造影劑組;C組為靶向超聲造影劑組。將上述各組Loops管道固定于搖床搖桿上,并浸于37℃的水浴槽中。采用超聲造影模式實時觀察Loops管內(nèi)的回聲,記錄超聲發(fā)現(xiàn)血栓出現(xiàn)的時間,并采用Line成像模式存儲在硬盤,脫機分析。實驗開始后10min、30min、

6、60min,分別將Loops管內(nèi)血液經(jīng)70μm過濾網(wǎng)過濾,其中過濾液行實驗室凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng)及胰島素含量檢測,血栓部分行病理學檢測。
　　 四、體內(nèi)IBMIR的超聲分子成像
　　 采用雄性SD大鼠(體重300±g)40只,3％戊巴比妥鈉腹腔麻醉,仰臥位捆綁固定;褪毛劑備皮腹部:腹中線切口約4cm,24G靜脈留置針穿刺并固定于腸系膜上靜脈,移植物經(jīng)此途徑移植入肝臟門靜脈系;采用4.5號頭皮針穿刺并固定于陰莖背靜脈,采用團

7、注法將0.4ml/kg超聲造影劑注入體內(nèi)。隨機分配實驗動物,各組均為5只,具體如下:A組為空白對照組,注射靶向超聲造影劑,不移植胰島:B組為普通造影劑對照組,注射普通超聲造影劑,移植胰島;C組為靶向造影劑微囊對照組,注射靶向超聲造影劑,移植海藻酸鈉微囊;D組為靶向造影劑實驗組,注射靶向超聲造影劑,移植胰島,D組按移植胰島后0、5、15、30、60分鐘等再分為五個小組,即D0、D5、D15、D30、D60。
　　 實時動態(tài)觀察肝臟

8、增強情況;于注射造影劑后5min、15min、30min、60min采集肝臟的左、中、右三個斷面的圖像,采用Line模式儲存于超聲儀硬盤,脫機分析。
　　 以上A、B、C各組,均于造影后30min,尾靜脈檢測血糖水平,采集腹主動脈血液行凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng)、C肽等水平檢測。實驗完畢,處死動物取肝臟組織10％福爾馬林固定,行病理學檢測。其中D組的D0、D5、D15、D30、D60小組,分別于造影后0min、5min、15min、30

9、min、60min采集血液及處死動物,取肝臟組織作病理學檢測。
　　 結果:
　　 一、血栓靶向超聲造影劑的制備與鑒定
　　 KGDS-TUCA靶向超聲造影劑呈淡黃色混懸液,微泡濃度約為1.5×109/ml,平均粒徑為1.5±0.2μm,98％微泡小于5μm。熒光顯微鏡顯示靶向超聲造影劑表面呈明亮的綠色熒光;流式細胞儀檢測KGDS結合效率為90.04％;體外4℃保存48h,微泡濃度及粒徑無顯著性改變;體內(nèi)團注靶向

10、超聲造影劑肝臟平均灰階值達109.98±18.01,持續(xù)時間長約15分鐘:體外靶向及其拮抗實驗,證實靶向超聲造影劑與血栓特異性結合;體內(nèi)下腔靜脈夾閉法建立血栓模型,采用靶向超聲造影劑可以增強下腔靜脈內(nèi)血栓。
　　 二、體外IBMIR模型的建立
　　 Tubing Loops內(nèi)肝素濃度為0.001mg/ml時對新鮮全血的正常生理功能影響最小,可以長時間模擬體內(nèi)血液生理功能不變。血液樣本加入新生豬胰島以后,1000IEQ實驗

11、組于10min開始出現(xiàn)了血凝塊,隨時間的延長,凝血塊逐漸增大。Tubing Loops管中血液的血小板數(shù)量隨時間延長而減少,β-TG、TAT顯著增加;血漿中C3a、C5b-9的增加;淋巴細胞、單核細胞被大量消耗;血凝塊病理學檢測顯示,胰島細胞周圍被血栓包圍,其周邊及血栓內(nèi)均可見中性白細胞浸潤,胰島移植物表面包膜被破壞,出現(xiàn)裂解征象。
　　 三、體外IBMIR的超聲分子成像
　　 體外Loops管內(nèi)加入的造影劑的劑量以0.

12、04ml為佳。A組沒有加入造影劑,不能發(fā)現(xiàn)血栓形成;B組加入自制普通超聲造影劑,Loops管內(nèi)可以顯示血栓,血栓周邊及內(nèi)部無增強,呈充盈缺損改變,發(fā)現(xiàn)血栓需要時間約為7.3±0.5min,超聲平均灰階值31.22±3.56;C組加入靶向超聲造影劑,Loops管內(nèi)可以清晰顯示環(huán)狀增強的血栓,發(fā)現(xiàn)血栓需要時間約為13.2±0.6min,超聲平均灰階值(level)為75.85±5.21。B組、C組血栓平均灰階值及發(fā)現(xiàn)時間比較均有統(tǒng)計學差異。

13、血液學檢測顯示實驗各組均發(fā)生了IBMIR,即凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng)活化,血液胰島素含量升高。病理檢測顯示,胰島與新鮮全血接觸后,其表面形成血栓殼,加入帶熒光的靶向超聲造影劑,熒光顯微鏡可以清楚觀察到胰島周邊呈明亮的熒光光環(huán),與血栓殼位置、形態(tài)、范圍完全吻合。
　　 四、體內(nèi)IBMRI的超聲分子成像
　　 1.各組肝臟超聲增強動態(tài)變化:團注超聲造影劑后,A組、B組、C組、D組于注射造影劑9秒后肝臟開始增強,A組、B組、C組造影

14、劑約于造影后2分鐘開始從肝臟廓清,15分鐘后基本廓清,30分鐘后完全廓清,肝臟內(nèi)未見增強聲像;D組造影劑也約于造影后2分鐘開始從肝臟廓清,但15分鐘后肝臟內(nèi)可見密集星點狀增強,持續(xù)監(jiān)測1h沒有消退;
　　 2.各組肝臟超聲增強定量分析:造影前,各組肝臟平均灰階值,約為7左右,差異無統(tǒng)計學意義;造影10min后,D組平均灰階值為52.22±6.73,明顯高于A組、B組、C組的平均灰階值(P<0.05);造影30分鐘后,A組、B組、

15、C組、D組平均灰階值均降低,A組、B組、C組與造影前相比差異無統(tǒng)計學意義,而D組平均灰階值明顯高于造影前強度。
　　 3.血液學檢測結果:A組、C組沒有移植微囊,其血液ATA、D-dimer、C3a、C5b-9、血糖等均沒有變化;B組、D組移植胰島30 min后,血液ATA、D-dimer、C3a、C5b-9明顯升高,血糖下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);D組內(nèi)各小組血液學指標顯示ATA于15min,C3a、C5b-9含量

16、于5min時達最高水平,分別為82±10.5μg/ml、45±4.6ng/ml、116±9.5 ng/ml,之后隨時間延長而逐漸降低,30 min時分別為41.2±4.7μgt/ml、11.7±5.3 ng/ml、29.6±8.3ng/ml,差異有統(tǒng)計學意義,而D-dimer則隨時間延長而逐漸升高(P<0.05)。
　　 結論:
　　 1.本研究采用“超聲勻化+高速機械剪切法”,首先合成KGDS-Palm化合物,以之為主

17、要原料,制備出靶向超聲造影劑,其合成方法簡單,制備過程中不需添加造影劑原料以外的材料,利于靶向造影劑的制備及純化;配體KGDS結合率高,達90.04％;KGDS-TUCA靶向超聲造影劑體內(nèi)外穩(wěn)定性好、靶向結合特異性強。
　　 2.胰島與新鮮全血接觸后,激活凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng),血小板、中性粒細胞、單核細胞大量消耗,胰島形態(tài)完整性被破壞,發(fā)生IBMIR.反應。采用1000IEQ新生豬胰島加至肝素終濃度為0.001mg/ml的含7ml

18、健康人新鮮全血的體外循環(huán)管道,固定于鐘擺式搖床中可以建立穩(wěn)定、標準化的IBMIR體外模型。
　　 3.體外胰島移植IBMIR模型,KGDS-TUCA靶向超聲造影劑可以靶向結合于胰島表面血栓殼,能有效顯示IBMIR的發(fā)生及其范圍、程度。
　　 4.肝內(nèi)移植胰島,激活凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng);機體為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性,相應的纖溶系統(tǒng)、補體調(diào)節(jié)系統(tǒng)被激活,凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng)活化受到對抗。注入KGDS-TUCA靶向超聲造影劑,可以特異