尼克酰胺抑制胰島移植后IBMIR作用的研究.pdf

1、近年來我國糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長的趨勢。對于嚴重危害人類尤其是年輕人健康的1型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病)，目前主要采用外源性胰島素替代的治療方法?；颊卟粌H需要終生使用胰島素，而且經(jīng)常會發(fā)生嚴重的低血糖反應，甚至出現(xiàn)致命的低血糖昏迷。移植不但是目前根治此病的唯一方法，而且可以降低代謝不穩(wěn)定性以避免低血糖昏迷的發(fā)生，又可以防止多種遠期的并發(fā)癥。近年來，全胰腺移植越來越多地被應用于臨床，但它具有較多弊?。核且环N創(chuàng)傷性療法，目前仍有較高

2、的死亡率；它所應用的免疫抑制方案常會引起嚴重的副反應。而胰島移植長期以來被認為是一種頗具吸引力的療法，它不僅操作簡便，死亡率極低，又具有反復操作性。所以長期以來，許多科研機構都致力于此項研究。 盡管胰島移植在治療1型和部分2型糖尿病有其獨特的優(yōu)勢，但其遠期療效不夠理想，其主要原因包括(1)胰島分離過程中的物理化學因素：例如低溫，缺氧。(2)胰島移植早期即刻經(jīng)血液介導的炎性反應(IBMIR)。(3)移植后機體對胰島細胞的免疫排斥反

3、應。 目前研究表明，胰島移植早期常伴有大量胰島的丟失，這種現(xiàn)象被統(tǒng)稱為原發(fā)性無功能，而與免疫因素無關。除了胰島制備中內(nèi)在的固有質量因素外，另外的一個重要原因就是新植入的胰島與血流接觸后所引發(fā)的反應，被稱為即刻經(jīng)血液介導的炎癥(Instant blood mediated inflammatory reaction以下簡稱IBMIR)，其反應特征是血小板的激活和凝血系統(tǒng)以及補體系統(tǒng)的激活。 有證據(jù)表明，分離后的胰島細胞可以

4、合成TF(tissue factor)，而TF是引起外源性血液凝集反應最重要的激活物。在臨床胰島移植中，胰島細胞一經(jīng)接觸受體的血液，產(chǎn)生的TF就會通過激活外源性凝血途徑導致血液的凝集反應，從而導致IBMIR的發(fā)生。MCP-1(macrophage chemoattractant Protein)在人類胰島中也有表達，MCP-1對單核細胞有趨化活性作用并且胰島移植前該蛋白的水平同臨床胰島移植的愈后密切相關。TF作為外源性凝血途徑的起始物，

5、MCP-1作為誘導趨化因子所引起IBMIR的反應有可能是臨床胰島移植低成功率以及需要不止一個供體才能使受體獲得正常的血糖水平的主要原因。 因此我們可以假設：在胰島的提純和分離過程中，胰島細胞的TF和MCP-1的表達可以被一些特殊物質所抑制。在不同的供體所提供的胰島中，由個體差異所引起的TF和MCP-1在MRNA和蛋白質階段不同的水平支持這種可能性。都知道生理學畸形經(jīng)常存在腦死亡的病人中，而且移植前的冷藏和組織缺氧能夠誘使各種促炎

6、性基因的表達。目前已經(jīng)有證據(jù)表明，尼克酰胺(一種B族維生素的衍生物)可以抑制TF和MCP-1在巨噬細胞和內(nèi)皮細胞中的表達[3]。因此在這個實驗中我們主要驗證已經(jīng)被證明可以抑制單核細胞和巨噬細胞中TF與MCP-1表達的尼克酰胺是否對胰島細胞有同樣的影響。應用它對移植前的胰島細胞進行預處理從而抑制IBMIR的發(fā)生。 材料與方法： 實驗動物：普通級封閉群Wistar大鼠，雌雄不限，重量250-300g(購自中國醫(yī)科大學實驗動物

7、部)。實驗第一部分：對照組：RPMI1640+胰島，實驗組：RPMI1640+胰島+尼克酰胺；實驗第二部分：實驗組：尼克酰胺預處理過的胰島細胞500單位+RPMI1640 100ul+2ml全血。對照組：基礎培養(yǎng)的胰島細胞500單位+RPMI1640 100ul+2ml全血，空白對照組：RPMI1640 100ul+2ml全血。 胰島提?。合蚬┦笠裙軆?nèi)原位逆行灌注膠原酶溶液(用冷的Hank's液配制，劑量為1.5mg/ml)10

8、-12ml，使胰腺充分膨脹。切取后在37±1℃水浴中振蕩消化，消化時間12-15 min。終止消化后，兩次離心洗滌，過80目篩。Ficoll梯度離心法純化胰島，濃度分別為25％、23％、20.5％和11％，離心后于23％和20.5％之間，及20.5％和11％之間交界處吸取胰島細胞，RPMI-1640洗滌兩次備用。獲取的胰島用雙硫腙染色來判斷所提胰島的純度，胰島細胞數(shù)=3次樣品中DTZ陽性細胞團數(shù)÷3×20×樣本總量(ml)。丫啶橙/溴乙

9、啶(AO/EB)熒光染色法顯示細胞活率。 提純后的胰島細胞與50mM尼克酰胺在37℃ 5％CO2的保溫箱中共同培養(yǎng)48h。通過體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗檢測不同培養(yǎng)條件下胰島活性并利用酶聯(lián)免疫方法測定混合培養(yǎng)后胰島細胞中TF與MCP1的含量。 體外模擬循環(huán)模型建立：該模型由長度為390mm，直徑為6.3mm聚乙烯管構成，將循環(huán)管的兩端通過三腔接頭連接，將相同的三個循環(huán)管固定置于擺動器上，并放入37℃水浴箱中，通過擺動

10、模擬體內(nèi)血液循環(huán)。 肝素化處理：將所有與大鼠血液相接觸的管道內(nèi)表面均涂以肝素，所用肝素濃度為0.5μg/cm2相當于0.1unit/cm2。 血液制備：新鮮的大鼠血液被收集于肝素化的20ml的注射器中。 血液分析：反應后的血液行血常規(guī)檢查，計數(shù)血小板，白細胞，淋巴細胞，單核細胞數(shù)，并通過葡萄糖刺激實驗檢測胰島功能。 組織形態(tài)學檢測：液基細胞學檢查檢測(TCT)，觀察胰島形態(tài)變化。 統(tǒng)計學分析：將所

11、得數(shù)據(jù)用均值±標準差表示。t檢驗進行處理，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.胰島提?。浩骄恐淮笫罂色@得約600IEQ胰島，經(jīng)DTZ染色后，純度>90％。胰島活率>98％。尼克酰胺混合培養(yǎng)48h后，體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗表明：對照組在低糖溶液中胰島素平均含量為57.8±6.79μIU/ml，高糖溶液中胰島素平均含量為199.45±14.80μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.47±0.40。實驗組低糖溶

12、液中胰島素平均含量為58.5±7.38μIU/ml，高糖溶液中胰島素平均含量為184.39±23.47μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.24±0.26。對照組中TF含量為9.90±2.12pg/islet，MCP1含量為2.22±0.58 pg/islet，實驗組中TF含量為1.42±0.42pg/islet，MCP1含量為0.33±0.13 pg/islet。 2.血液分析：對照組中血小板數(shù)分別為(n=10)258.1±82

13、.4×109/L、40.9±12.9×109/L、實驗組血小板為232.5±73.5×109/L。對照組中白細胞數(shù)分別為9.05±0.98×109/L、4.54±0.92×109/L，實驗組中白細胞為7.39±1.10×109/L。對照組中淋巴細胞百分數(shù)分別為73.5±9.8％、49.8±9.98％，實驗組中淋巴細胞為68.6±10.34％。對照組中單核細胞數(shù)分別為0.52±0.16×109/L、0.30±0.12×109/L，實驗組中

14、單核細胞0.4±0.15×109/L。 3.與血液接觸后胰島素刺激實驗結果：對照組在低糖溶液中胰島素平均含量為24.24±6.22μIU/ml，高糖溶液中胰島素平均含量為49.02±16.14μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為1.98±0.29。實驗組低糖溶液中胰島素平均含量為43.5±8.08μIU/ml，高糖溶液中胰島素平均含量為130.76±21.41μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.02±0.29。 4.TCT檢