胰島移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景] 胰島移植是治愈Ⅰ型糖尿病的一種有效方法，但目前臨床胰島移植效果還不很滿意，免疫排斥反應(yīng)是胰島移植的主要障礙之一。研究發(fā)現(xiàn)Fas/FasL系統(tǒng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是免疫豁免的重要機(jī)制，它是通過(guò)識(shí)別活化的淋巴細(xì)胞表達(dá)FasL，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，從而降低局部的免疫反應(yīng)。將具有局部免疫豁免作用且能表達(dá)FasL的睪丸Sertoli細(xì)胞與胰島細(xì)胞在腎包膜下共移植，可提高移植細(xì)胞的存活率及降低免疫排斥反應(yīng)。由于肝臟為機(jī)體內(nèi)免疫性相對(duì)較弱的

2、器官，同時(shí)，胰島細(xì)胞在肝內(nèi)生長(zhǎng)，有利于其營(yíng)養(yǎng)物的供給及對(duì)血糖水平監(jiān)測(cè)；胰島釋放的胰島素直接作用于肝臟，符合機(jī)體的生理途徑，有利于血糖的調(diào)節(jié)。本研究探究胰島與表達(dá)FasL的睪丸Sertoli細(xì)胞在肝內(nèi)共移植效果及對(duì)受體肝臟的影響。 [方法] 胰島的分離純化 將釋放酶經(jīng)大鼠膽總管向胰腺灌注，然后用分次法消化胰腺。將分離的胰島沉淀物用Ficoll-400純化，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，用雙硫棕(DTZ)法判定胰島細(xì)胞純度，用

3、吖啶橙/碘丙啶(AO/PI)法判定胰島細(xì)胞存活率。然后將胰島細(xì)胞懸浮于含100ml/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。 糖尿病模型建立 糖尿病Wistar大鼠誘導(dǎo)通過(guò)一次性腹腔注入2％的鏈脲霉素(60mg/kg體重)，誘導(dǎo)成功后14-21天后移植。 血糖監(jiān)測(cè) 非空腹血糖連續(xù)兩天高于11.2mmol/L及尿糖陽(yáng)性，作為移植物受排斥、功能喪失的指標(biāo)。 胰島分

4、泌功能的測(cè)定 選100個(gè)純化的胰島培養(yǎng)，分別于第24h、48h測(cè)定培養(yǎng)液中胰島素含量，并于培養(yǎng)第48h用間接放射免疫法胰島細(xì)胞做葡萄糖刺激釋放試驗(yàn)。 睪丸細(xì)胞分離純化 無(wú)菌條件從腹腔內(nèi)取出2～3周齡SD大鼠睪丸，剪成碎塊，置于10ml含0.33g/L釋放酶的培養(yǎng)瓶中振蕩消化，經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾后，用HBSS/EDTA液洗滌。然后用胰蛋白酶和DNaseⅠ消化，經(jīng)篩網(wǎng)再過(guò)濾后，用HBSS/EDTA液再洗滌，在倒置顯微鏡下對(duì)分

5、離純化的睪丸Sertoli細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用臺(tái)盼藍(lán)染色判斷睪丸細(xì)胞的活性，最后置含10％的FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d。將不同數(shù)量或已經(jīng)過(guò)抗FasL單克隆抗體(FasL-mAb)處理的SD大鼠睪丸細(xì)胞分別加入Wistar大鼠脾細(xì)胞懸液中培養(yǎng)，按MTT比色法測(cè)OD值，判斷睪丸細(xì)胞對(duì)活性淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。淋巴細(xì)胞毒性百分率(％)=(1-試驗(yàn)孔OD值/對(duì)比孔OD值)×100％。 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用寶靈曼原位細(xì)胞

6、凋亡檢測(cè)試劑盒(POD)，采用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的熒光素-dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)。 免疫組化 取受體左半肝臟，用福爾馬林固定，石蠟包埋切片，常規(guī)病理染色，切片加兔抗FasL、鼠抗Insulin抗體孵育，而后使用SABC試劑盒，通過(guò)卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物標(biāo)記，測(cè)定Insulin及FasL表達(dá)。 胰島睪丸細(xì)胞肝內(nèi)共移植 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)A 24只受體Wistar糖尿病大鼠隨機(jī)

7、分為3組： A組(n=8)，為對(duì)照組，不接受任何細(xì)胞移植，僅從門(mén)靜脈注入生理鹽水1ml。 B組(n=8)，將1000個(gè)SD大鼠胰島細(xì)胞與1×107個(gè)SD大鼠睪丸細(xì)胞從門(mén)靜脈主干移植到全肝。 C組(n=8)，將1000個(gè)SD大鼠胰島細(xì)胞與1×107個(gè)SD大鼠睪丸細(xì)胞從門(mén)靜脈左支移植到肝左葉。 每組受體大鼠在細(xì)胞移植前和細(xì)胞移植后2d、7d分別取血，測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AS

8、T)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)， 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)B 24只受體Wistar糖尿病大鼠隨機(jī)分為3組： A組(n=8)，為對(duì)照組，不接受任何細(xì)胞移植，僅從門(mén)靜脈注入生理鹽水1ml。 B組(n=8)，將1000個(gè)SD大鼠胰島細(xì)胞與1×107個(gè)SD大鼠睪丸細(xì)胞從門(mén)靜脈主干移植到全肝。 C組(n=8)，將1000個(gè)SD大鼠胰島細(xì)胞與1×107個(gè)SD大鼠睪丸細(xì)胞從門(mén)靜脈左支移植到肝左葉。

9、每組受體大鼠在細(xì)胞移植前、細(xì)胞移植后即刻及細(xì)胞移植后7d分別測(cè)門(mén)靜脈壓力一次。細(xì)胞移植后7d各組取肝左葉組織做光鏡、電鏡、細(xì)胞凋亡、Insulin及FasL表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)C 24只受體Wistar糖尿病大鼠隨機(jī)分為3組： A組(n=8)，為對(duì)照組，不接受任何細(xì)胞移植，僅從門(mén)靜脈注入生理鹽水1ml。 B組(n=8)，將1000個(gè)SD大鼠胰島細(xì)胞與1×107個(gè)SD大鼠睪丸細(xì)胞從門(mén)靜脈主干移植到全肝。

10、 C組(n=8)，將1000個(gè)SD大鼠胰島細(xì)胞與1×107個(gè)SD大鼠睪丸細(xì)胞從門(mén)靜脈左支移植到肝左葉。 每組大鼠在細(xì)胞移植前和細(xì)胞移植后7d分別取血，測(cè)定血清超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)。 門(mén)靜脈壓力測(cè)定 用套管針穿刺門(mén)靜脈成功后，接三通管裝置，先測(cè)門(mén)靜脈主干壓力，然后從套管注入移植細(xì)胞沉淀，再測(cè)一次門(mén)靜脈主干壓力，7天后，按以上方法再測(cè)門(mén)靜脈主干壓力。

11、 大鼠氧自由基測(cè)定 由南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供試劑盒，按硫代巴妥酸(TBA)法測(cè)定丙二醛(MDA)；按黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活力；按硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮(NO)。 組織學(xué)檢查 取移植胰島細(xì)胞7d的大鼠肝臟左葉，光鏡下觀察其顯微結(jié)構(gòu)；透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)。 [結(jié)論] 1.表達(dá)FasL的睪丸Sertoli細(xì)胞與胰島細(xì)胞同時(shí)在糖尿病大鼠肝內(nèi)共移植后，可誘導(dǎo)活化T

12、淋巴細(xì)胞凋亡，對(duì)移植胰島細(xì)胞產(chǎn)生局部的免疫耐受作用。 2.氧自由基損傷存在于表達(dá)FasL的睪丸Sertoli細(xì)胞與胰島細(xì)胞同時(shí)在糖尿病大鼠肝內(nèi)共移植過(guò)程中，將胰島移植物經(jīng)大鼠門(mén)靜脈左支移植于肝左葉比經(jīng)門(mén)靜脈主干移植于全肝，可減少氧自由基損傷。 3.胰島睪丸細(xì)胞肝內(nèi)共移植可引起門(mén)靜脈壓力升高，經(jīng)大鼠門(mén)靜脈左支將胰島細(xì)胞和睪丸Sertoli細(xì)胞移植于肝左葉比經(jīng)門(mén)靜脈移植于全肝，其對(duì)門(mén)靜脈壓力的影響明顯減少。 4.將胰