骨髓多能間質(zhì)細胞與胰島聯(lián)合移植對移植胰島新生血管形成影響及其機制的研究.pdf

1、目的：
　　 實驗一:隨著外科手術(shù)、免疫抑制藥物、胰島分離純化技術(shù)的迅速發(fā)展，胰島移植已成為治療糖尿病的理想途徑之一。然而目前在胰島分離純化過程中仍然沒有一種專門用于胰島分離純化分離液，應(yīng)用UW液等器官保存液仍然面臨著純化效率低下，胰島保護作用差等問題，因此，目前迫切需要研發(fā)一種分離效率高、胰島保護作用強、成本低的胰島分離液。在總結(jié)國內(nèi)外器官保存液的仇缺點后，我們結(jié)合胰島細胞能量代謝特點并遵循器官保存液配制的原則，我們成功配制了

2、一種新型的胰島分離液。本實驗對該胰島分離液與Optiprep配合形成的不同密度的梯度密度分離液在小鼠胰島分離中的分離效率及胰島保護作用進行了研究，并與UW液與Optiprep組成的梯度密度分離液進行了對比。
　　 實驗二:胰島細胞具有高度的代謝活性，胰島移植后的無血管期及后期的血管形成不良是造成胰島丟失進而導(dǎo)致胰島移植低效性與短效性的重要原因之一，因此通過相應(yīng)策略加快移植后胰島周圍新生血管生成并增加血管密度成為了近期胰島移植領(lǐng)域

3、研究的熱點。目前已有部分文獻報道了MSCs可以促進移植胰島周圍新生血管的生成。然而仍有許多內(nèi)容值得深入探討。1.目前研究中的糖尿病模型僅為STZ的誘導(dǎo)模型，不能很好的模擬糖尿病的發(fā)病及免疫機理。2.移植受體為同基因或免疫缺陷受體，雖避免了免疫耐受的誘導(dǎo)及移植后的免疫排斥，但不能真實的反應(yīng)MSC的治療效果。3.目前MSCs都是通過與胰島混合后共同移植于腎被膜下，MSCs能否通過趨化歸巢特性遷移到胰島移植部位來發(fā)揮其相應(yīng)作用尚未有文獻證明。

4、4.MSCs在體內(nèi)與胰島聯(lián)合移植后能否分化為血管內(nèi)皮或平滑肌細胞尚未獲得公認。因此本實驗擬采用自發(fā)糖尿病模型小鼠，通過骨髓移植及應(yīng)用免疫抑制劑誘導(dǎo)免疫耐受，之后給予同種異體胰島移植并經(jīng)靜脈途徑聯(lián)合MSCs移植，來探討MSCs對移植胰島功能及移植后新生血管形成的影響及其機制。
　　 方法：
　　 SPF級BALB/c小鼠（4周齡）、SPF級BALB/c小鼠（8-12周齡）、SPF級NOD/Lt小鼠（8-12周齡）均購自北京

5、華阜康生物科技股份有限公司。
　　 胰島分離純化:應(yīng)用1％異氟醚麻醉BALB/c小鼠后，V字型切開小鼠腹壁，在膽總管末端進行結(jié)扎，經(jīng)左右肝管匯合處進針，注入含有2mg/ml膠原酶的消化液，使胰腺膨脹，之后切取胰腺。將胰腺置于37℃的水浴中消化10分鐘。將消化后的胰腺進行連續(xù)梯度密度離心純化胰島。
　　 胰島移植:對梯度密度離心純化后的胰島進行人工挑選進行二次純化，將純度達到99％的胰島轉(zhuǎn)移到PE50管中并離心沉降。糖尿病

6、小鼠麻醉后，在左側(cè)肋下取斜切口暴露腎臟，在腎臟下極劃破腎被膜，再將裝有胰島的PE50管插入腎被膜下植入胰島，縫合切口。
　　 骨髓細胞提取及輸注:切取BALB/c小鼠的后腿，清除所有肌肉組織，用剪刀剪斷干骺端暴露骨髓腔，用帶有26號針頭的20ml注射器吸取PBS后沖洗骨髓腔。骨髓細胞經(jīng)沖洗、裂解紅細胞后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×108/ml，之后將0.3ml細胞懸液(即6×107)經(jīng)尾靜脈輸注到NOD/Lt小鼠體內(nèi)。
　　

7、 骨髓多能間質(zhì)細胞提取:以骨髓細胞提取相同的方法收集BALB/c小鼠骨髓細胞。不經(jīng)紅細胞裂解直接向骨髓細胞中加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。每日換液直至細胞達到90％密度時，用0.25％胰酶消化并傳代。經(jīng)2次傳代后骨髓多能間質(zhì)細胞可達到99％純度。此時可收取細胞并進行移植。
　　 免疫耐受誘導(dǎo):在行骨髓移植前3天將1×108劑量BALB/c小鼠脾細胞經(jīng)尾靜脈輸注到NOD/Lt小鼠體內(nèi)。骨髓移植前一天

8、給予200mg/Kg單劑量環(huán)磷酰胺腹腔注射。骨髓移植當(dāng)天給予6×107中等劑量骨髓干細胞移植，同時開始應(yīng)用MR1聯(lián)合抗BTLA單抗治療，抗-CD154單克隆抗體MR10.5mg每日腹腔注射至術(shù)后第5天，之后于第7、10、14天給予MR1;抗BTLA單抗移植當(dāng)天0.5mg腹腔注射，之后0.25mg于第2、4、6、8及10天腹腔注射。
　　 實驗一:消化后的胰腺按體積平均分為兩組，分別應(yīng)用IPS-Optiprep液及UW-Optip

9、rep液進行連續(xù)梯度密度離心純化胰島。胰島分離純化前后分別從兩組組織懸液中吸取50ul懸液各3次，通過雙硫腙將胰島染色，完成計數(shù)及純度、完整度、回收率檢測，之后通過FDA\PI來分析純化后胰島的活性，對比兩種分離液的純化效率及胰島保護效果。最后將200IEQ胰島移植入STZ誘導(dǎo)糖尿病BALB/c小鼠左側(cè)腎被膜下，每日監(jiān)測血糖水平，并在術(shù)后第21天完成腹腔糖耐量檢測，對比兩種分離液純化胰島的在體活性及功能。
　　 實驗二:骨髓細胞

10、移植前3天應(yīng)用脾細胞行NOD鼠尾靜脈注射，單劑環(huán)磷酰胺(200mg/kg)于骨髓干細胞移植前1天腹腔注射，骨髓細胞移植當(dāng)天行60million/鼠中等量骨髓細胞移植。骨髓干細胞移植當(dāng)天，抗-CD154單克隆抗體MR10.5mg每日腹腔注射至術(shù)后第5天，之后于第7、10、14天給予MR1;抗BTLA單抗移植當(dāng)天0.5mg腹腔注射，之后0.25mg于第2、4、6、8及10天腹腔注射。骨髓細胞移植術(shù)后2周，實驗組行MSCs與胰島左腎被膜下聯(lián)合

11、移植治療糖尿病NOD鼠。對照組1僅行胰島細胞移植;對照組2僅行MSCs移植。術(shù)后監(jiān)測NOD鼠血糖變化及糖耐量變化，了解移植物生存等情況。骨髓細胞移植后每周檢測外周血淋巴細胞細胞嵌合體水平。術(shù)后2、4、8周切取移植側(cè)腎臟檢測移植胰島的再血管化、胰島再生及凋亡情況，并檢測MSCs是否分化為血管內(nèi)皮細胞或平滑肌細胞，檢測MSCs分泌VEGF及HGF情況。
　　 結(jié)果：
　　 實驗一:IPS液具有良好的胰島分離效率，它提高了胰島

12、的純度與回收率。實驗中我們還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用UW純化后的胰島中混有較多未被消化的毛細血管，這些毛細血管片段極易粘附胰島，不僅降低了胰島的純度還增加了之后人工挑選過程的難度，而應(yīng)用IPS液則明顯的減少了毛細血管片段的含量。此外IPS液更好的保護了胰島的形態(tài)，并且提高了胰島的完整度。我們分析這可能與加入烏司他丁有關(guān)，因為烏司他丁能起到保護胰島避免受到破損的外分泌細胞釋放出的蛋白酶的破壞的作用。在胰島活性方面，應(yīng)用IPS液純化的胰島的活性較UW液差，

13、其機制并不清楚，我們猜測可能與IPS液內(nèi)含有較多的內(nèi)毒素有關(guān)。將應(yīng)用兩種保存液純化后的胰島同體移植于STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠后，兩組中所有小鼠的血糖均恢復(fù)到了正常水平，且均可維持30天，并未顯現(xiàn)出胰島功能方面的差異。在價格方面，IPS液具有明顯的優(yōu)勢，顯著的降低了分離成本。
　　 實驗二:MSCs與胰島聯(lián)合移植與單獨胰島移植組均能明顯改善移植后小鼠的血糖水平，治療成功率達到100％。而MSCs單獨移植組糖尿病小鼠的血糖并未得到改善

14、，且MSCs并未向胰島細胞轉(zhuǎn)化，單獨進行骨髓多能間質(zhì)細胞移植并不能達到治療糖尿病的目的。MSCs聯(lián)合移植可促進胰島移植后的再生，減少胰島移植后的凋亡。胰島移植后2、4、8周，MSCs聯(lián)合移植組移植胰島周圍血管密度均明顯多于單獨胰島移植組。MSCs聯(lián)合移植明顯增加了NOD小鼠的嵌合水平。嵌合率的增高可以加強同種異體胰島移植物的嵌合、增強其免疫耐受，進而保護胰島的功能及活性。MSCs可以遷移到胰島移植部位，并可以轉(zhuǎn)化為血管平滑肌細胞或血管內(nèi)

15、皮細胞以及分泌VEGF因子。由此增加了移植胰島的血供、改善了胰島的代謝活性，保護了移植胰島的功能與活性。
　　 結(jié)論：
　　 實驗一:我們綜合各種器官保存液的優(yōu)缺點設(shè)計的這種新型胰島分離液在胰島分離提純中與UW液相比顯示出更好的分離效率，增加了胰島的純度、完整度與回收率，并明顯的降低了純化成本。在對胰島功能保護方面與液與UW液相當(dāng)，然而對胰島細胞活性的保護卻不及UW液。
　　 實驗二:本實驗在采用與人糖尿病發(fā)病機

16、制相似的糖尿病NOD小鼠、通過骨髓移植及應(yīng)用免疫抑制劑誘導(dǎo)免疫耐受之后，完成同種異體胰島移植并聯(lián)合靜脈途徑MSCs移植。證明了MSCs可以遷移到移植胰島周圍并通過轉(zhuǎn)化為血管平滑肌細胞或血管內(nèi)皮細胞以及通透分泌VEGF因子來促進移植胰島周圍新生血管生成，由此增加了移植胰島的血供，保護了移植胰島的功能與活性。MSCs還可以通過增加NOD小鼠的嵌合水平來增強同種異體胰島移植物的免疫耐受，進而保護胰島的功能及活性。此外，在本實驗中我們還發(fā)現(xiàn)MS