移植胰島細(xì)胞和骨髓單個核細(xì)胞治療糖尿病實驗研究.pdf

1、背景：1型糖尿?。↖DDM）是自身免疫引起的胰島素分泌細(xì)胞數(shù)量減少的疾病，可導(dǎo)致患者血糖升高引起并發(fā)癥的發(fā)生，包括心血管疾病、失明、腎衰竭。這類病人通常需要每天注射胰島素控制血糖，但是使用胰島素有可能引起低血糖、暈厥、麻痹甚至死亡等意外的發(fā)生。Lacy于1982年進(jìn)行了第1例胰島移植，由于胰島細(xì)胞移植成功率較低，結(jié)果不甚理想，這種技術(shù)的應(yīng)用受到一定限制，直到2000年Edmonton胰島細(xì)胞移植方案建立之后，移植的成功率才有了極大的提高

2、。盡管這樣，胰島細(xì)胞移植仍然面臨許多困難，首先是供體的短缺，其中不到1%的患者能夠得到供體進(jìn)行移植，其次胰島細(xì)胞移植的適用癥逐漸擴(kuò)大，其中包括了胰腺腫瘤、慢性胰腺炎的病人，這樣就使供體短缺更加嚴(yán)重。
　　 目的：1）對比非禁食與禁食后腹腔注射鏈脲佐菌素（50mg/kg）誘導(dǎo)糖尿病大鼠2周后的模型存活率；2）對比預(yù)冷（4℃）膠原酶灌注法與Hanks灌注法消化后胰島細(xì)胞的獲得量；3）本實驗對比通過尾靜脈、肝臟和胰腺三種途徑移植胰島細(xì)

3、胞、骨髓單個核細(xì)胞治療糖尿病的效果；4）觀察骨髓單個核細(xì)胞在免疫排斥反應(yīng)中的抑制作用；5）觀察細(xì)胞種類與移植途徑之間的關(guān)系。
　　 方法：1）Wistar大鼠48只，6～8周，體重約200～250g，雌雄不限，非禁食經(jīng)腹腔單次注射鏈脲佐菌素溶液（STZ，50mg/kg），冰浴和避光，并于30分鐘內(nèi)完成，注射后大鼠頭部向下倒置約30秒，放回飼養(yǎng)籠內(nèi)自由進(jìn)食水，用血糖儀連續(xù)測定2次，隨機(jī)血糖均≥16.8mmol/L，出現(xiàn)典型的糖尿病

4、臨床癥狀：多飲、多食、多尿、體重下降，認(rèn)為造模成功；2）大鼠麻醉后，開腹逆行灌注切取胰腺后剪碎，大小約1×1×1mm3，移入提前預(yù)熱的裝有10ml膠原酶V溶液的錐形瓶內(nèi)，于37℃水浴箱內(nèi)120－180回/min震蕩消化15～20min，取少量細(xì)胞上清液于倒置顯微鏡下觀察，如呈單個胰島細(xì)胞團(tuán)，并與間質(zhì)組織脫離，可吸出上清液，加入預(yù)冷的Hanks緩沖液50ml終止消化，手動強(qiáng)烈振蕩離心管，使胰島細(xì)胞與間質(zhì)充分脫離，剩余胰腺組織可加入膠原酶V

5、溶液2～5ml繼續(xù)消化；如胰島細(xì)胞與間質(zhì)組織未脫離，可繼續(xù)消化，隨時觀察胰腺組織消化情況，直至消化完全。消化結(jié)束后將細(xì)胞懸液輕柔吹打均勻，用80目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，將過濾后的細(xì)胞懸液移入50ml離心管中，在低溫離心機(jī)中（4℃），1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心4min，重復(fù)洗滌2次，沉淀即為消化的胰腺組織。將25%的Ficoll400溶液4ml加入消化洗凈的胰腺組織中，輕柔充分混合均勻，然后依次緩慢加入23%、20%、10%的Ficoll40

6、0溶液各2ml，1500r/min，離心10 min，純化的胰島細(xì)胞集中于23～20%和20～10%之間，小心吸取收集，Hanks液重復(fù)洗滌2次，雙硫腙染色計數(shù)1000個備用；3）切取上述大鼠四肢骨，裝入培養(yǎng)皿中置于超凈工作臺上，取出四肢骨放入裝有雙抗PBS10ml的離心管中，浸泡15min后取出，再放入裝有10mlPBS的15ml離心管中，浸泡10min取出，用咬骨鉗剪去兩端骨骺，用含有10%胎牛血清（FBS）的L-DMEM溶液5ml

7、沖洗骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨頭發(fā)白，再換用26G的注射器吹打兩次，使之成為單細(xì)胞懸液，在15ml的離心管中加入5ml淋巴細(xì)胞分離液，再將單細(xì)胞懸液緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液之上，緩慢加樣保持液面層清晰，1600r/min密度梯度離心20分鐘分離骨髓單個核細(xì)胞（BMMC），用直頭滴管吸出液面層之間的單個核細(xì)胞，加入Hanks緩沖液10ml，1600r/min離心洗滌4min，重復(fù)2次，2%臺盼藍(lán)染色細(xì)胞，正置顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整成所需濃度的細(xì)胞懸

8、液（1×107/ml），移植備用；4）模型制作成功后隨機(jī)分組，A組肝臟被膜下移植1000個胰島細(xì)胞，B組肝臟被膜下移植1000個胰島+1×107骨髓單個核細(xì)胞，C組經(jīng)尾靜脈移植1000個胰島細(xì)胞，D組經(jīng)尾靜脈移植1000個胰島細(xì)胞+1×107骨髓單個核細(xì)胞，C組和D組移植之后在腹部切小切口并縫合，E組胰腺被膜下移植1000個胰島細(xì)胞，F(xiàn)組胰腺被膜下移植1000個胰島+1×107骨髓單個核細(xì)胞，各組移植后皮下注射青霉素20萬單位預(yù)防感染。

9、分別于移植前1天、第0、1、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天，觀察并記錄模型大鼠血糖變化。血糖測定結(jié)束后，處死大鼠切取胰腺、肝臟、肺臟、脾臟組織器官，觀察臟器大體形態(tài)后，修剪并切取部分組織，置于4%多聚甲醛固定4～6h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，常規(guī)石蠟制片，蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察組織病理變化。數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0 統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果：1）非禁食腹腔注射鏈脲佐菌素（50mg/kg）大鼠均可成

10、模，血糖≥16.8mmol/L，模型成模率為100%，且較非禁食組模型穩(wěn)定；2）分離純化后的胰島細(xì)胞經(jīng)雙硫腙（DTZ）染色鑒定并計數(shù)，胰島細(xì)胞呈猩紅色圓形或團(tuán)塊狀，細(xì)胞體積較小且致密，與外分泌腺體細(xì)胞分離，外分泌腺體細(xì)胞體積較大，雙硫腙不著色，細(xì)胞折光性強(qiáng)，通過計數(shù)胰島細(xì)胞回收率約為60-70%，純化后的胰島細(xì)胞純度較高，可達(dá)90%以上，每只大鼠可獲得（520±53）個胰島；3）淋巴細(xì)胞分離液分離的骨髓單個核細(xì)胞，經(jīng)2%臺盼藍(lán)染色后在正

11、置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈折光性強(qiáng)，圓形，細(xì)胞純度較高，死細(xì)胞呈淡藍(lán)色；4）肝臟被膜下移植胰島細(xì)胞大鼠血糖于術(shù)后3天內(nèi)開始下降至正常，下降趨勢較明顯，A組血糖可降至正常水平，平均血糖為（7.98±2.28）mmol/L，可維持（3.71±0.95）天，B組可降至正常水平，平均血糖為（7.72±1.75）mmol/L，可維持（4.86±1.06）天，C組經(jīng)尾靜脈移植胰島細(xì)胞大鼠血糖于術(shù)后4天內(nèi)降至正常，下降趨勢較肝臟組緩慢，血糖可降至正常水平

12、，平均血糖為（7.35±1.40）mmol/L，可維持（7.85±1.46）天，D組于移植后4天內(nèi)起效，血糖可降至正常水平，平均血糖為（7.00±0.83）mmol/L，可維持（14.1±1.21）天，E組移植后24小時血糖降至正常水平（7.06±2.11）mmol/L，可維持（24.90±2.60）天，F(xiàn)移植后24小時血糖降至正常水平（8.21±1.22）mmol/L，可維持（39.80±2.57）天，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計的方差分析表明各組

13、間血糖隨時間變化的趨勢不同（P＜0.05），各組血糖維持正常水平的時間不全相同（P＜0.05），血糖變化趨勢與移植途徑之間有交互作用；5）糖尿病大鼠胰腺組織大體標(biāo)本見胰腺體積縮小，顏色與周圍脂肪相似。病理切片經(jīng)HE染色后顯示胰腺組織中可見散在分布的胰島細(xì)胞，數(shù)量減少，胰島細(xì)胞體積減小，與周圍外分泌腺細(xì)胞對比界限較明顯。糖尿病大鼠肝臟組織大體標(biāo)本見肝葉飽滿，切面呈紅褐色。病理切片經(jīng)蘇木素-伊紅染色（HE染色）后顯示肝臟被膜下移植后出現(xiàn)嚴(yán)重

14、的炎癥反應(yīng)，呈現(xiàn)局灶樣炎癥壞死，炎癥細(xì)胞浸潤到肝臟內(nèi)。
　　 結(jié)論：1）本實驗采用非禁食腹腔注射鏈脲佐菌素（50mg/kg）制作糖尿病大鼠模型，成模率高，模型穩(wěn)定，模型鼠隨機(jī)血糖均高于16.8mmol/L，胰腺組織形態(tài)學(xué)變化明顯；2）本實驗采用預(yù)冷的Hanks灌注胰腺分離胰島細(xì)胞，胰島細(xì)胞形態(tài)呈圓形或團(tuán)塊狀，回收率尚可，可以保護(hù)胰島細(xì)胞的完整；3）本實驗在胰腺部位移植胰島細(xì)胞較肝臟被膜下、靜脈移植維持血糖正常的時間長，提示通過在