骨髓動(dòng)員與動(dòng)員后單個(gè)核細(xì)胞移植治療糖尿病大鼠后肢缺血的療效比較.pdf

1、目的：糖尿病足發(fā)病率逐年增高，已成為非創(chuàng)傷性截肢的主要原因。其主要發(fā)病原因是下肢供血障礙，且主要為流出道閉塞，即越遠(yuǎn)端閉塞越重，故搭橋、介入均難再通。近年來(lái)隨著干細(xì)胞研究的進(jìn)展以及分離、純化干細(xì)胞方法的不斷改進(jìn)，使采用干細(xì)胞治療等治療性血管生成方法在缺血部位重建有效的側(cè)支循環(huán)成為可能，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了將骨髓單個(gè)核細(xì)胞植入梗死部位后可促進(jìn)局部的血管生成。
　　 2002年Tateishi-Yuyama等在國(guó)際首次報(bào)道了應(yīng)用骨髓

2、造血干細(xì)胞移植治療周圍血管病患者的臨床報(bào)告，接受自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療的43例下肢動(dòng)脈缺血性疾病患者均獲得了滿意的療效。2003年后國(guó)內(nèi)外應(yīng)用干細(xì)胞分離儀采集動(dòng)員后的外周血干細(xì)胞移植獲得成功。
　　 2006年張楠等報(bào)道了骨髓動(dòng)員在糖尿病小鼠缺血肢體新生血管形成中的作用，2007年有學(xué)者報(bào)道了內(nèi)皮祖細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)糖尿病大鼠血管病變療效的比較，但對(duì)骨髓動(dòng)員與單個(gè)核細(xì)胞移植治療療效的比較尚未見報(bào)道。毛細(xì)血管密度改變是判斷

3、干細(xì)胞移植術(shù)療效的直觀證據(jù)和客觀指標(biāo)，為臨床提供依據(jù)。
　　 本研究旨在：1、通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)復(fù)制動(dòng)物（SD大鼠）糖尿病模型及后肢缺血模型，通過(guò)毛細(xì)血管密度的改變比較骨髓動(dòng)員與單個(gè)核細(xì)胞移植治療的療效。2、觀察單個(gè)核細(xì)胞移植前后毛細(xì)血管密度改變，進(jìn)一步判斷其療效，為臨床提供依據(jù)。3通過(guò)內(nèi)皮動(dòng)能的監(jiān)測(cè)，觀察骨髓動(dòng)員與單個(gè)核細(xì)胞移植治療對(duì)糖尿病大鼠全身血管病變的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)對(duì)象SD大鼠36只，雄性，8周齡，體重180

4、-250克之間，制備糖尿病大鼠后肢缺血模型，隨機(jī)選取30只大鼠進(jìn)行骨髓動(dòng)員，其中15只進(jìn)行骨髓動(dòng)員（B組），15只于動(dòng)員后行單個(gè)核細(xì)胞移植（A組），其余6只為空白對(duì)照組（C組），制做雙后肢缺血模型，不進(jìn)行骨髓動(dòng)員及單個(gè)核細(xì)胞移植。骨髓動(dòng)員前及動(dòng)員后3天（移植前）、移植后第2、4周于內(nèi)眥靜脈取血檢測(cè)ET水平，單個(gè)核細(xì)胞移植后4周取雙后肢肌肉做病理檢查，檢測(cè)毛細(xì)血管密度并進(jìn)行A組與B組治療效果比較。
　　 1、糖尿病大鼠模型的制備<

5、br>　　 大鼠禁食12小時(shí)后，按65mg/kg劑量一次性腹腔注射1％鏈脲佐菌素（STZ）1.5-2ml，給藥72小時(shí)后連續(xù)兩次通過(guò)尾靜脈采血，檢測(cè)空腹血糖>16.65mmol/L作為糖尿病大鼠模型。
　　 2、糖尿病大鼠后肢血管病變模型的制備
　　 麻醉大鼠后，取其雙側(cè)腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)上下各行一縱行缺口，分離、結(jié)扎、離斷股動(dòng)脈及其分支。觀察3天，手術(shù)后肢逐漸萎縮，活動(dòng)力下降，無(wú)壞疽，為糖尿病大鼠后肢血管病變模型的制

6、備成功。
　　 3、骨髓動(dòng)員和動(dòng)員后單個(gè)核細(xì)胞的分離及移植
　　 糖尿病后肢缺血模型制備成功后，A組及B組皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF，150ug.kg-1.d-1），同時(shí)C組每天皮下注射生理鹽水1ml/d，連續(xù)3天。A組用10％水合氯醛麻醉后，心臟直接采血5ml，用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×108/ml，以1ml注射器自結(jié)扎部位以下每0.5cm注射0.1ml，B組及C組

7、同法等量采血后注射等量PBS（磷酸鹽緩沖溶液），繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠4周。
　　 4、外周血WBC和CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　 動(dòng)脈離斷術(shù)后當(dāng)天隨機(jī)從A、B、C三組大鼠各選5只大鼠內(nèi)眥靜脈取血0.5ml，同法骨髓動(dòng)員3天后以上大鼠各取血0.5ml，采用Ficoll液離心制備外周血單個(gè)核細(xì)胞，F(xiàn)ITC-CD34+單抗標(biāo)記后用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)WBC和CD34+細(xì)胞。
　　 5、血管內(nèi)皮功能生化指標(biāo)的測(cè)定
　　 血漿內(nèi)

8、皮素（ET）采用放射免疫分析法測(cè)定，單位：pg/ml。
　　 6、注射部位肌肉中毛細(xì)血管密度的測(cè)定
　　 常規(guī)方法制備大鼠肌肉光鏡組織切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，免疫組織化學(xué)法行vWF染色進(jìn)行毛細(xì)血管密度的測(cè)定。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)前后用配對(duì)資料t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩組以上比較采用單因素方

9、差分析。顯著性用P值表示，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察
　　 雙側(cè)股動(dòng)脈離斷后3天大鼠缺血后肢逐漸萎縮，活動(dòng)力下降，所有動(dòng)物在處死取材時(shí)局部均無(wú)明顯壞疽。
　　 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)WBC和CD34+細(xì)胞結(jié)果顯示：
　　 A組動(dòng)脈離斷術(shù)后當(dāng)天WBC和CD34+細(xì)胞分別為（7.37±1.36）×109/L和（0.15±0.04）％，動(dòng)

10、員3天后WBC和CD34+細(xì)胞分別為（22.53±2.44）×109/L和（2.27±0.38）％，明顯高于動(dòng)員前（P<0.05），B組動(dòng)脈離斷術(shù)后當(dāng)天WBC和CD34+細(xì)胞分別為（7.83±1.15）×109/L和（0.15±0.05）％，動(dòng)員3天后WBC和CD34+細(xì)胞分別為（23.09±2.44）×109/L和（2.29±0.36）％，明顯高于動(dòng)員前（P<0.05），說(shuō)明肢體缺血和G-CSF動(dòng)員能明顯提高外周血WBC和CD34+細(xì)

11、胞含量。C組動(dòng)脈離斷術(shù)后當(dāng)天WBC和CD34+細(xì)胞分別為（7.38±1.15）×109/L和（0.16±0.05）％，未行動(dòng)員3天后WBC和CD34+細(xì)胞為（9.82±1.40）×109/L和（0.45±0.10）％，CD34+細(xì)胞比例明顯增高（P<0.05），說(shuō)明肢體缺血能明顯提高外周血CD34+細(xì)胞含量。A、B兩組外周血WBC數(shù)和CD34+細(xì)胞含量均明顯高于C組（P<0.01），但A、B兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

12、　　 3、血漿ET的測(cè)定
　　 A組、B組及C組動(dòng)員前ET水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），移植前（動(dòng)員后3天），移植后2周，移植后4周ET水平均低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），A組和B組各期ET水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 4、毛細(xì)血管密度的測(cè)定
　　 A組和B組vWF染色陽(yáng)性的毛細(xì)血管密度分別為5.8±1.9個(gè)/HP、4.9±1.6個(gè)/HP，均高于C組3.7±1.8個(gè)/HP，

13、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），A組毛細(xì)血管密度高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）
　　 結(jié)論：
　　 1、骨髓動(dòng)員和動(dòng)員后單個(gè)核細(xì)胞移植均可促進(jìn)缺血后肢毛細(xì)血管的生成，本研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)員后單個(gè)核細(xì)胞移植效果優(yōu)于單純骨髓動(dòng)員。
　　 2、通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞發(fā)現(xiàn)骨髓動(dòng)員能明顯提高外周血CD34+細(xì)胞含量，促進(jìn)后肢毛細(xì)血管的生成。
　　 3、通過(guò)ET水平的變化發(fā)現(xiàn)骨髓動(dòng)員和動(dòng)員后單個(gè)核細(xì)胞