激活內(nèi)皮祖細(xì)胞wnt-β-catenin信號通路有助于糖尿病大鼠后肢缺血的細(xì)胞移植治療.pdf

1、目的：血管內(nèi)皮修復(fù)和血管新生的細(xì)胞學(xué)材料為內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）和內(nèi)皮細(xì)胞。主要通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究高糖環(huán)境誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)是否影響內(nèi)皮祖細(xì)移植治療糖尿病后肢缺血效果，探討氧化應(yīng)激反應(yīng)如何引起wnt/β-catenin信號通路失衡，進(jìn)而導(dǎo)致EPCs移植療效受限。
　　方法：體外實(shí)驗(yàn)：快速處死大鼠，收集下肢骨髓腔中細(xì)胞（MNCs），采用Ficoll密度梯度離心法、貼壁培養(yǎng)法分離

2、和培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)，使用連續(xù)形態(tài)觀察、鑒定EPCs；使用分子探針經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測（DCFH-DA）檢測正常糖濃度（N=）處理后EPCs的氧化應(yīng)激水平變化；據(jù)不同方法分為7組：N、HG、HG+DMSO（XAV-939溶劑）、DM+Licl（β-catenin的激活劑）、HG+tempol（氧化應(yīng)激抑制劑）、HG+H2O2、HG+tempol+XAV-939（β-catenin的抑制劑）處理EPCs后，使用結(jié)晶紫法檢測EPCs黏附TNFa預(yù)處理

3、HUVEC的的細(xì)胞數(shù)量，使用免疫蛋白印跡法檢測其wnt/β-catenin信號通路重要相關(guān)蛋白 T-β-catenin(總β-catenin)、NP-β-catenin（非磷酸化-β-catenin）以及介導(dǎo)的相關(guān)黏附功能蛋白VCAM-1表達(dá)的情況。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：鏈脲佐菌素腹腔打（STZ）針構(gòu)建糖尿病大鼠模型，持續(xù)監(jiān)測血糖2月，建立糖尿病動物模型，使之進(jìn)食高脂飼料，手術(shù)顯微鏡下行左側(cè)股動脈及其大分支結(jié)扎離斷術(shù)以建立糖尿病單側(cè)后肢缺血模型，并

4、觀察未進(jìn)行EPCs移植情況下，血流恢復(fù)情況，以判斷是否造模成功。將健康、同窩大鼠后肢骨髓中單核細(xì)胞經(jīng)上述方法分離、培養(yǎng)出 EPCs，術(shù)后24小時(shí)內(nèi)按107/100g量經(jīng)尾靜脈移植入大鼠動物模型體內(nèi)，在術(shù)前、術(shù)后（0d）、7d、14d、28d行連續(xù) LDPI檢查以觀察移植治療效果。分為三組：健康大鼠后肢缺血模型經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水（H+NS）、糖尿病大鼠后肢缺血模型經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水（DM+NS）和糖尿病大鼠后肢缺血模型經(jīng)尾靜脈注射內(nèi)皮

5、祖細(xì)胞（DM+EPCs），術(shù)后28天抽取外周血經(jīng)分光光度儀檢測氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物MDA和抗氧化指標(biāo)SOD水平。分為七組處理：H+NS、DM+NS,DM+EPCs、DM+EPCs+DMSO、DM+EPCs+tempol、DM+EPCs+Licl、DM+EPCs+XAV-939和DM+EPCs+tempol+XAV-939，經(jīng)方法分離出來的 EPCs，經(jīng) PKH-26標(biāo)記示蹤后，按107/100g量經(jīng)尾靜脈移注射入各組后肢缺血大鼠模型體內(nèi)，在

6、術(shù)前、術(shù)后（0d）、7、14、28行連續(xù)LDPI檢查，并在術(shù)后28天取大鼠左后肢腓腸肌和外周血，采用ELISA檢測血清中wnt3a、wnt5a和wnt7a的量，并篩選可能的起作用調(diào)節(jié)因子；抽取外周血經(jīng)分光光度檢測氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物MDA和抗氧化指標(biāo)SOD水平；經(jīng)ROS分子探針DCFH-DA和DHE在熒光顯微鏡下觀察缺血腓腸肌中氧化應(yīng)激水平；在熒光顯微鏡鏡下觀察缺血腓腸肌血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31示血管數(shù)量和PKH-26示蹤的遷移、黏附細(xì)胞數(shù)量

7、；使用Western blotting檢測缺血腓腸肌wnt/β-catenin信號通路重要相關(guān)蛋白 T-β-catenin(總β-catenin)、NP-β-catenin（非磷酸化-β-catenin）以及介導(dǎo)的相關(guān)黏附功能蛋白VCAM-1表達(dá)的情況。
　　結(jié)果：經(jīng)專用培養(yǎng)基EGM-2培養(yǎng)觀察：2d，培養(yǎng)的EPCs為貼著培養(yǎng)孔板生長，呈圓形，少有呈橢圓形。7d，細(xì)胞增大、變?yōu)槊黠@橢圓形或梭形生長；14d，觀察可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)“鵝卵

8、石”樣、漩渦樣生長。通過激光共聚焦顯微鏡下見，細(xì)胞可見經(jīng)過 DiI-ac-LDL處理后陽性的 EPCs為紅色熒光，結(jié)合了FITC-UEA-1后的EPCs為黃色熒光，雙染法陽性的細(xì)胞為正在分化的EPCs。結(jié)扎左側(cè)后肢的股動脈及其主要分支后經(jīng)激光多普勒測定血流量比值，無論糖尿病體內(nèi)，還是 EPCs處于高糖環(huán)境中，兩者的活性氧產(chǎn)物都增加（P<0.05）。糖尿病組體內(nèi)MDA水平比健康大鼠體內(nèi)MDA水平高(P<0.05)，且手術(shù)和移植EPCs操作

9、均對大鼠MDA水平無影響(P>0.05)；糖尿病大鼠與正常大鼠體內(nèi)氧化相比應(yīng)激水平增高，并導(dǎo)致抑缺血后肢血流恢復(fù)的受限，且能被氧化抑制劑所逆轉(zhuǎn)。糖尿病體ROS增加的情況下，T-β-catenin、NP-β-catenin相對蛋白表量減少，特別是 NP-β-catenin減少明顯，與正常組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，進(jìn)而通過Licl和XAV-939調(diào)節(jié)T-β-catenin、NP-β-catenin表達(dá)量，可以引起移植治療血流恢復(fù)

10、的改變：缺血后肢遷移的EPCs數(shù)量、新生血管數(shù)量和血流值大小與其表達(dá)量成正相關(guān)關(guān)系。血清中Wnt5a與糖尿病缺血下肢血流改善有密切關(guān)聯(lián)，而wnt3a、wnt7a變化不符合血流恢復(fù)趨勢。糖尿病體內(nèi)wnt/β-catenin信號低下，引起 VCAM1-1表達(dá)減少(P<0.05)；而體外高糖處理 EPCs后， wnt/β-catenin信號通路低下可能引起VCAM-1的降低(P<0.05)，也許能導(dǎo)致EPCs黏附到缺血部位的能力減弱(P<0.