凝血酶抑制劑—阿加曲班抑制胰島移植后IBMIR的研究.pdf

1、糖尿病是常見的內(nèi)分泌代謝疾病，其引發(fā)的多種并發(fā)癥嚴(yán)重危害人們的身心健康，只有建立內(nèi)源性胰島素分泌系統(tǒng)才能根治糖尿病。目前主要有胰腺移植和胰島移植兩種方法能達(dá)到此治療目的。胰島移植屬于細(xì)胞移植范疇，雖然目前胰島移植對(duì)外源性胰島素依賴性的解除不如胰腺移植高，但與胰腺移植相比具有安全、簡便、利于體外移植物修飾、不良反應(yīng)較低和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，已成為很有發(fā)展前景的方法。 盡管胰島移植在治療1型和部分2型糖尿病有其獨(dú)特的優(yōu)勢，但其遠(yuǎn)期療效不

2、夠理想，其主要原因包括(1)供體胰島的分離和純化技術(shù)尚不完善，無法獲得數(shù)量及質(zhì)量都上乘的胰島細(xì)胞， (2)免疫排斥反應(yīng)， (3)胰島缺血缺氧損傷，(4)胰島移植早期即刻經(jīng)血液介導(dǎo)的炎性反應(yīng)(IBMIR)。 目前研究表明，胰島移植早期常伴有大量胰島的丟失，這種現(xiàn)象被統(tǒng)稱為原發(fā)性無功能，而與免疫因素?zé)o關(guān)。除了胰島制備中內(nèi)在的固有質(zhì)量因素外，另外的一個(gè)重要原因就是新植入的胰島與血流接觸后所引發(fā)的反應(yīng)，被稱為立即經(jīng)血液介導(dǎo)的炎癥(Ins

3、tant blood mediated inflammatory reaction以下簡稱IBMIR)，其反應(yīng)特征是血小板的激活和凝血系統(tǒng)以及補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，這些瀑布反應(yīng)導(dǎo)致胰島的損傷。當(dāng)胰島細(xì)胞與ABO血型相容性的血液相互接觸之后，5 min即出現(xiàn)凝血現(xiàn)象。血小板與胰島表面迅速的結(jié)合并導(dǎo)致血液中血小板的迅速減少，緊接著是纖維蛋白形成并圍繞在胰島的表面以及大量炎性細(xì)胞浸潤和補(bǔ)體的活化，接著就出現(xiàn)血液凝固，從而引起胰島細(xì)胞的破壞。綜上所述

4、，這些反應(yīng)也都是由血小板的活化和凝血反應(yīng)所引起的。因此尋找一種有效的抑制血小板活化和凝血反應(yīng)的方法將可以阻止IBMIR的發(fā)生，從而減少移植早期胰島的破壞。 研究表明，凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，由凝血酶原轉(zhuǎn)換而來，它不但是凝血反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的酶，而且是一種有效的血小板活化劑，它通過與血小板表面的PAR-1和PAR-4結(jié)合激活血小板，因此凝血酶抑制劑將會(huì)有效的抑制凝血的發(fā)生和血小板的活化，從而抑制IBMIR。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用體外模擬

5、血管模型構(gòu)建IBMIR模型并通過加入凝血酶抑制劑(阿加曲班)研究其對(duì)胰島移植早期IBMIR的抑制作用。 材料與方法： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：普通級(jí)封閉群Wistar大鼠，雌雄不限，重量250-300g(購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組即經(jīng)60min循環(huán)反應(yīng)無胰島細(xì)胞組(2mlblood+RPMI-1640 150μl)，對(duì)照組即經(jīng)60min循環(huán)反應(yīng)含胰島組(2mlblood+RPMI-1640 150μl+800當(dāng)

6、量胰島)，實(shí)驗(yàn)組即(2mlblood+RPMI-1640 150μl+阿加曲班1ml+800當(dāng)量胰島)。 胰島提取：向供鼠胰管內(nèi)原位逆行灌注膠原酶溶液(用冷的Hank's液配制，劑量為1.5mg/ml)10-12ml，使胰腺充分膨脹。切取后在37±1℃水浴中振蕩消化，消化時(shí)間12-15 min。終止消化后，兩次離心洗滌，過80目篩。Ficoll梯度離心法純化胰島，濃度分別為25％、23％、20.5％和11％，離心后于23％和20

7、.5％之間，及20.5％和11％之間交界處吸取胰島細(xì)胞，RPMI-1640洗滌兩次備用。獲取的胰島用雙硫腙染色來判斷所提胰島的純度，胰島細(xì)胞數(shù)=3次樣品中DTZ陽性細(xì)胞團(tuán)數(shù)÷3×20×樣本總量(ml)。丫啶橙/溴乙啶(AO/EB)熒光染色法顯示細(xì)胞活率，體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗(yàn)檢測胰島活性。 肝素化處理：將所有與大鼠血液相接觸的管道內(nèi)表面均涂以肝素，所用肝素濃度為0.5μg/cm2,相當(dāng)于0.1unit/cm2。

8、血液制備：新鮮的大鼠血液被收集于肝素化的20ml的注射器中。 體外模擬循環(huán)模型建立：該模型由長度為390mm，直徑為6.3mm聚乙烯管構(gòu)成，管的內(nèi)表面涂以固定化的肝素，將循環(huán)管的兩端通過肝素化的三腔接頭連接，將循環(huán)管固定于擺動(dòng)器上，并放入37℃溫箱中，通過擺動(dòng)模擬體內(nèi)血液循環(huán)。 反應(yīng)后指標(biāo)檢測：將反應(yīng)后的胰島行葡萄糖下胰島素刺激試驗(yàn)，評(píng)價(jià)胰島功能。大鼠血液經(jīng)血常規(guī)檢查，計(jì)數(shù)血小板，白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞數(shù)。

9、組織形態(tài)學(xué)檢測：反應(yīng)后過濾血液，將組織塊行TCT檢測，觀察胰島形態(tài)變化及周圍包繞細(xì)胞類型。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：將所得數(shù)據(jù)用均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.胰島提?。浩骄恐淮笫罂色@得約500-600IEQ胰島，經(jīng)DTZ染色后，純度>90％。胰島活率>95％。體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗(yàn)表明，新鮮胰島在低糖溶液中胰島素平均含量58.1±3.5μIU/ml，高糖溶液中胰島素平

10、均含量為195.2±12.61μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.35±0.20，說明胰島功能較好，對(duì)照組中胰島在低糖下胰島素平均含量為46.1±3.2μIU/ml，高糖下胰島素平均含量為103.2±11.8μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為2.25±0.18，說明胰島功能明顯受損，實(shí)驗(yàn)組中低糖下胰島素釋放量為53.6±3.3μIU/ml，高糖下胰島素釋放量為180.2±10.8μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.36±0.18說明胰島功

11、能較好。 2.血液分析：對(duì)照組中血小板數(shù)為(n=10)38±14×109/L，實(shí)驗(yàn)組中血小板數(shù)為255±85×109/L，兩組間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，對(duì)照組中白細(xì)胞數(shù)為4.2±0.96×109/L，實(shí)驗(yàn)組中白細(xì)胞數(shù)8.1±1.19×109/L，兩組間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，對(duì)照組中單核細(xì)胞數(shù)為(n=10)0.25±0.10×109/L，實(shí)驗(yàn)組中單核細(xì)胞數(shù)為0.41±0.13×109/L，兩組間有明顯的統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)差異(p<0.05)，對(duì)照組中淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為51.5±8.5％，實(shí)驗(yàn)組中淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為66.2±9.8％，兩組間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。 3.TCT 檢測：對(duì)照組中胰島明顯減少，被膜不完整，胰島周圍見大量紅細(xì)胞形成的微血栓，而實(shí)驗(yàn)組中胰島形態(tài)較完整，數(shù)量較多，周圍無炎性細(xì)胞浸潤，也未見明顯微血栓形成。 結(jié)論： 1.IBMIR是胰島移植早期胰島損傷的主要原因。 2.應(yīng)用凝血酶抑制劑阿加曲班可