細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)靶向超聲分子成像評價(jià)大鼠移植腎急性排斥反應(yīng).pdf

1、背景和目的:移植腎急性排斥反應(yīng)(Acute reiection,AR)是腎移植術(shù)后常見并發(fā)癥,最易導(dǎo)致移植腎早期功能喪失,是移植腎存活和維持功能的主要障礙之一。研究表明,當(dāng)AR發(fā)生時(shí),首先表現(xiàn)為移植腎微血管內(nèi)皮損傷,血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)或分泌一些與排斥反應(yīng)有關(guān)的炎性分子標(biāo)記物如細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellularadhesion molecule,ICAM—1)、血管細(xì)胞間粘附分子-1(Vascular cell adhesio

2、nmolecule,VCAM-1)等,這些炎性分子標(biāo)記物能夠促進(jìn)T細(xì)胞、血小板或其它炎性細(xì)胞沿血管內(nèi)皮滾動(dòng)、粘附、聚集和外滲,后者可介導(dǎo)血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)并釋放多種炎癥介質(zhì)或促炎細(xì)胞因子進(jìn)入到腎間質(zhì)組織,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白細(xì)胞介素-1(IL-1),血栓素A2(TXA2)等,進(jìn)而導(dǎo)致移植腎臟組織及微血管損傷。因此,一定程度上講,血管內(nèi)皮損傷是移植腎AR的最早階段,檢測血管內(nèi)皮所表達(dá)的特殊分子標(biāo)記物如ICAM-1有可能早期評

3、估移植腎AR的存在。
　　 事實(shí)上,長期以來,學(xué)者們對移植腎排斥反應(yīng)的診斷,特別是急性排斥反應(yīng)的診斷進(jìn)行了多種多樣的研究,以求在組織學(xué)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)改變之前達(dá)到早期、準(zhǔn)確地診斷并開始治療。眾多研究者從免疫學(xué)監(jiān)測、移植腎影像學(xué)和病理學(xué)檢測等多方面進(jìn)行了大量有益的探索與研究。但不同的檢測手段和方法均有各自的局限性,如腎閃爍掃描術(shù)可以評價(jià)缺血性損傷,但在腎移植術(shù)后早期并不能鑒別AR、急性腎小管壞死和環(huán)孢素中毒,僅對何時(shí)恢復(fù)及移植腎短期或

4、長期存活有一定價(jià)值。而MRI、PET等其它非靶向性放射性成像方法雖對評估腎移植后形態(tài)學(xué)和代謝變化能夠提供有價(jià)值的參考信息,但PET和MRI等方法存在著一些無法克服的缺點(diǎn):例如,儀器要求高,不能床邊檢查,放射示蹤劑缺乏穩(wěn)定性及具有放射污染等,使其臨床應(yīng)用受到一定的限制。目前,移植腎穿刺取組織進(jìn)行病理學(xué)檢查仍是診斷AR的最準(zhǔn)確方法。但由于腎穿刺損傷大,易發(fā)生出血及其它嚴(yán)重并發(fā)癥,故不能作為常規(guī)監(jiān)測手段。因此,尋找一種安全、無創(chuàng)、敏感的檢測手

5、段對AR做出早期診斷具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　 近年來,隨著靶向超聲微泡造影劑的出現(xiàn),靶向超聲分子顯像(Targetedultrasound molecular imaging)逐漸成為現(xiàn)實(shí),極大拓展了傳統(tǒng)超聲微泡的應(yīng)用范圍,其作為血管內(nèi)示蹤劑能特異地粘附于血管內(nèi)皮表面從而在行超聲檢查時(shí)被探測到,這使得應(yīng)用超聲技術(shù)從分子水平對各種疾病進(jìn)行早期診斷成為可能。目前,靶向超聲分子成像技術(shù)已經(jīng)成功地對腎臟、下肢、腫瘤等部位的血管內(nèi)皮炎癥

6、/血管新生進(jìn)行了評價(jià),對心臟移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測也進(jìn)行了初步探索。但移植腎AR由于小動(dòng)物腎移植模型構(gòu)建復(fù)雜、繁瑣等因?yàn)?關(guān)于其靶向成像的研究尚屬于空白階段。我們實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過多年的探索和技術(shù)改進(jìn),靶向超聲微泡構(gòu)建研究也取得了相當(dāng)大的成果,構(gòu)建的靶向超聲微泡大小和濃度、穩(wěn)定性、抗體攜帶率等均已達(dá)到國際同等或更高水平,并且依靠血管內(nèi)皮炎癥相關(guān)因子(ICAM-1)靶向超聲微泡成功實(shí)現(xiàn)了對腎臟、心臟等的血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)評價(jià)。在前期工作基礎(chǔ)之上,本研究

7、嘗試?yán)脴?gòu)建的靶向腎臟微血管內(nèi)皮表面細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)靶向超聲微泡和對比超聲相結(jié)合,并采用先進(jìn)的超聲成像技術(shù)(將對微泡的破壞性降到最低)對移植腎AR進(jìn)行早期評價(jià)和診斷,這無疑具有重要臨床意義。
　　 因此,本研究在普通脂質(zhì)微泡的基礎(chǔ)上,通過“抗生物素蛋白/生物素復(fù)合體”的化學(xué)橋接作用將抗大鼠ICAM-1單克隆抗體連接于脂質(zhì)微泡外殼構(gòu)建了攜帶抗ICAM-1的靶向超聲微泡(MBI),并在大鼠移植腎AR模型上,應(yīng)用MB

8、I和對比超聲(CEU)檢查相結(jié)合,目的在于探討MBI結(jié)合CEU評價(jià)大鼠移植腎AR的可行性。
　　 材料和方法
　　 1.超聲微泡的制備與評價(jià)
　　 1.1.超聲微泡的制備各種相關(guān)脂質(zhì)材料按一定質(zhì)量比例75℃水浴溶解于適量蒸餾水中,同時(shí)通全氟丙烷(C3F8)氣體,超聲振蕩至形成乳白色液體制備生物素(biotin)化脂質(zhì)微泡(MB)。MB經(jīng)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合脂質(zhì)純化1次后,按一定比例加入抗生蛋白鏈

9、菌素(streptavidin)。繼續(xù)靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗生蛋白鏈菌素純化微泡1次后,按一定比例加入生物素化的抗大鼠細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和同型對照抗體(isotype control antibody),分別得到攜帶抗ICAM-1單抗靶向超聲微泡(MBI)和同型對照微泡(MB),最后靜置棄下清液并加入等量蒸餾水去除未結(jié)合抗體純化微泡1次,冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 1.2.超聲微泡體外評價(jià):

10、r>　　 1.2.1.庫爾特計(jì)數(shù)儀測量超聲微泡的平均粒徑及濃度。采用綠色熒光標(biāo)記的二抗與抗大鼠ICAM-1單克隆抗體結(jié)合熒光顯微鏡下觀察ICAM-1單抗與微泡外殼的連接情況。
　　 1.2.2.平行板流動(dòng)腔評價(jià)超聲微泡粘附性能應(yīng)用包被有大鼠ICAM-1抗原的聚苯乙烯培養(yǎng)皿作為平行板流動(dòng)腔體外檢測微泡粘附穩(wěn)定性的平臺。以普通脂質(zhì)微泡非特異性粘附效果為對照,采用大鼠ICAM-1(1000ng/μl抗原濃度)包被檢測MBI粘附特異性

11、及效能,所有分組均按平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)說明書要求檢測3個(gè)樣本(n=3)。MBI及MB(1×108/ml)經(jīng)微量注射泵以0.5dyn/cm2剪切應(yīng)力分別通過“大鼠ICAM-1抗原”包被的平行板流動(dòng)腔,自顯微鏡下觀察到有微泡出現(xiàn)后開始連續(xù)錄像6min,觀察每分鐘微泡的靶向結(jié)合情況。
　　 1.2.3.大鼠腎臟對比超聲(Contrast enhanced ultrasound,CEU)評價(jià)超聲微泡顯影效果:SD大鼠給予腹腔注射3％烏拉坦

12、-水合氯醛麻醉后,背部備皮,尾靜脈插管,使用sequoia512超聲機(jī),固定17L5探頭在腎臟長軸,固定探頭頻率為7MHz,深度25mm,機(jī)械指數(shù)0.18,動(dòng)態(tài)范圍80分貝,經(jīng)尾靜脈注射1mlMB或MBI后以0.2ml生理鹽水沖管,CPS實(shí)時(shí)成像,所有圖像存儲于MO盤備用。
　　 2.大鼠移植腎AR模型的構(gòu)建
　　 2.1.移植前準(zhǔn)備:供、受體均在移植前禁食12h,自由飲水,以3％戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉。<

13、br>　　 2.2.供體移植:麻醉成功后備皮,常規(guī)消毒鋪中。取腹部正中切口,由劍突至恥骨聯(lián)合。以自制拉鉤將腹壁向左右拉開,將全部腸管、胃、脾臟翻置腹腔外,濕紗布覆蓋,顯露左腎、左輸尿管和膀胱。游離出腹主動(dòng)脈、下腔靜脈,用5/0絲線結(jié)扎左精索靜脈及左腎上腺靜脈并剪斷,去除腎脂肪囊,分離左輸尿管至膀胱,該過程中注意盡量保留輸尿管周圍脂肪組織,以免影響輸尿管血供。顯微血管鉗阻斷下腔靜脈和腹主動(dòng)脈上、下端,由腹主動(dòng)脈下端插入灌注管,在下腔靜脈

14、下端剪一開口,4℃有肝素林格氏液(251U/ml)經(jīng)腹主動(dòng)脈插管灌注,灌洗至左腎和所屬血管完全蒼白,下腔靜脈流出液變清澈為止,灌注量5-10ml。拔出腹主動(dòng)脈插管,切斷腎動(dòng)、靜脈,分離出左腎后放入盛有0℃-4℃乳酸林格氏液的小盤里。
　　 2.3.受體移植:步驟同上,受體SD大鼠作腹部正中切口。由劍突至恥骨聯(lián)合,同樣將腸管推向右側(cè),以溫鹽水紗布包裹。近腎門處結(jié)扎左腎動(dòng)、靜脈及輸尿管,并切除受體左腎。用10-0無損傷縫線將供體腎和

15、受體腎的同名腎動(dòng)、靜脈做端端吻合。血流恢復(fù)后,移植腎顏色逐漸轉(zhuǎn)為紅潤,明亮,腎靜脈充盈,腎動(dòng)脈搏動(dòng)明顯,5-10min左右可見輸尿管蠕動(dòng),表明模型構(gòu)建成功。
　　 2.4.移植后處理:予肌注抗生素,視情況予以補(bǔ)液,注意保溫。
　　 3.靶向超聲分子成像:實(shí)驗(yàn)分為兩組,分別為接受腎移植術(shù)72h后的SD大鼠移植腎臟(腎移植組,n=10)與未經(jīng)過任何處理SD大鼠右側(cè)腎臟(對照組,n=10)。對腎移植組及對照組SD大鼠行二維、彩

16、色多普勒及對比超聲檢查。超聲造影時(shí)兩組分別注入靶向超聲微泡(MBI)和對照超聲微泡(MB)。SD大鼠俯臥位,用支架固定Sequoia512超聲機(jī)(Siemens,美國)的高頻超聲探頭(17L5)于大鼠移植腎臟上方,調(diào)整探頭位置獲得良好腎臟顯像后保持在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不變,儀器的各項(xiàng)參數(shù)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不變。CEU檢查均采用相干脈沖序列成像技術(shù)(Coherent Pulse Sequence,CPS)實(shí)時(shí)觀察,探頭發(fā)射頻率為7.0MHZ,機(jī)

17、械指數(shù)為0.2。每只大鼠采用微量進(jìn)樣器經(jīng)尾靜脈隨機(jī)(間隔30min)先后注射MB和MBI的數(shù)量約為1×109個(gè)。在注入微泡3min后行CEU檢查,獲取第一幀圖像后繼續(xù)存儲圖像2-3幀后給予高M(jìn)I的連續(xù)超聲發(fā)射2-3s以破壞微泡,繼續(xù)存儲本底圖像2-3幀,全部聲學(xué)造影視頻存于CD盤,以備脫機(jī)分析。微泡破壞前存儲圖像的平均聲強(qiáng)度(Video Intensity,VI)可代表靶向超聲微泡在組織中的總濃度,包括粘附和循環(huán)微泡。微泡破壞后存儲圖像

18、上的平均VI代表的是在血池中循環(huán)微泡的濃度。前者減去后者得到的是粘附微泡在組織中的濃度。
　　 取圖結(jié)束后,應(yīng)用CEU圖像分析軟件(Virginia大學(xué),美國)對圖像進(jìn)行分析,測量大鼠移植腎組及對照組腎臟造影VI值,單位為灰階強(qiáng)度(U)；并用彩色編碼技術(shù)制作腎臟顯影的彩色編碼圖像,采用紅色、橙色和白色依次代表顯影強(qiáng)度由弱到強(qiáng)。
　　 4.腎臟病理學(xué)檢查:CEU圖像采集后。取出大鼠腎臟,10％甲醛固定。常規(guī)脫水、石蠟包埋制

19、片。切片作蘇木素-伊紅(臟)染色和免疫組化檢查。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料用(x)±s表示,各組不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)合微泡個(gè)數(shù)比較用重復(fù)測量的方差分析,各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)兩組間單獨(dú)效應(yīng)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行分析；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用二階段交叉設(shè)計(jì)方差分析,P<0.05為差異有顯著性意義。
　　 結(jié)果
　　 1.MBI構(gòu)建及制

20、備效果的體外評價(jià)
　　 1.1.MBI制備及理化性質(zhì)鑒定:采用聲振法制備MB及MBI在顯微鏡下觀察均為透亮微氣泡,庫爾特計(jì)數(shù)儀檢測MB平均直徑為2.86μm,濃度為1.7×109個(gè)/ml,MBI平均直徑為2.71μm,濃度為1.5×109個(gè)/ml。
　　 1.2.MBI制備效果體外評價(jià)
　　 1.2.1.熒光標(biāo)記法評價(jià)抗體連接情況:采用綠色熒光標(biāo)記的二抗與抗大鼠ICAM-1單抗結(jié)合,熒光顯微鏡下顯示MBI外殼顯明

21、顯綠色熒光,表明抗ICAM-1單抗與微泡外殼連接良好
　　 1.2.2.平行板流動(dòng)腔體外評價(jià)MBI靶向粘附效能:平行板流動(dòng)腔體外評價(jià)結(jié)果顯示,在模擬微血管生理血流條件的剪切應(yīng)力(0.5dyn/cm2)下MBI可與包被于平行板流動(dòng)腔的ICAM-1抗原有效結(jié)合,MBI結(jié)合數(shù)量隨著時(shí)間延長而不斷增加,顯示了良好的主動(dòng)性靶向黏附效能。普通對照微泡結(jié)合數(shù)量同樣隨著時(shí)間延長而增加但同靶向超聲微泡相比其結(jié)合數(shù)量顯著降低,兩者差異顯著(F=42

22、0.116,P=0.000)。
　　 1.2.3.經(jīng)外周靜脈注射超聲微泡MBI或MB,在大鼠腎臟中均可獲得滿意的聲學(xué)造影效果。
　　 2.靶向超聲分子成像
　　 2.1.二維超聲及CEU檢查結(jié)果:二維超聲提示移植腎稍增大,形態(tài)稍飽滿,腎皮質(zhì)彩色血流信號略減少,對照組腎臟形態(tài)、大小正常,血流信號正常；移植腎及對照組腎在注入靶向超聲微泡后均可見腎臟區(qū)域明顯灌注顯影,在延遲3min顯象后第一幀CEU圖像顯示移植腎-MB

23、I組可見顯著的超聲顯影增強(qiáng)。而移植腎-MB組僅見輕度的超聲顯影增強(qiáng),其顯影強(qiáng)度較前者明顯減弱;而對照-MBI組及對照-MB組延遲3min顯象后,右側(cè)腎臟均未見明顯顯影增強(qiáng)。
　　 2.2.對比超聲VI分析:移植腎-MBI組和移植腎-MB組VI值分別為(27.0±7.4)U、(10.2±2.4)U,前者同后者相比VI值增大,兩者之間具有顯著性差異(F=64.744,P=0.000)。對照-MBI組及對照-MB組VI值分別為(7.7

24、±2.2)U、(6.5±1.0)U,兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.868,P=0.129)。移植腎-MBI組VI值分別為對照-MBI組及對照-MB組VI值的(3.74±1.3)倍(t=7.907,P=0.000)、(4.2±1.2)倍(t=8.661,P=0.000),兩者之間具有顯著差異。而移植腎-MB組VI值同對照-MBI組及對照-MB組相比,兩者之間具有顯著差異(t=2.423,P=0.026;t=4.417,P=0.001)

25、,但僅分別為后兩者(1.44±0.4)倍、(1.6±0.6)倍。
　　 3.腎臟病理檢查結(jié)果:移植腎組織中可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性,內(nèi)可見管型和壞死脫落細(xì)胞,伴腎間質(zhì)水腫及中性粒細(xì)胞增多；對照組腎臟組織中腎小管排列整齊,形態(tài)正常,間質(zhì)無充血、水腫。
　　 4.免疫組化檢查:移植腎組織腎小球微血管內(nèi)皮表面、腎小管上皮ICAM-1(棕黃色陽性反應(yīng)物,箭頭處)表達(dá)明顯增加；而對照組腎組織血管內(nèi)皮表面未見明顯的ICAM-1表

26、達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1.平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)證實(shí)采用生物素-親和素橋連方式制備出的攜帶ICAM-1靶向超聲微泡隨著時(shí)間的推移粘附數(shù)量不斷地增加,提示其靶向粘附能力良好,可以用來評價(jià)病變組織的血管內(nèi)皮炎癥。
　　 2.采用供腎血管與受體同名血管作端端吻合,大大減少了對受體循環(huán)系統(tǒng)的影響,保證了良好的術(shù)后生存期,為實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步進(jìn)行建立堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 3.應(yīng)用攜帶抗ICAM-1單抗靶向超聲微泡行對比超聲檢查可