基于KDR為靶點(diǎn)的靶向超聲微泡對(duì)腫瘤新生血管分子顯像的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 新生血管在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，隨著對(duì)腫瘤血管生成分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的逐漸深入，以腫瘤血管異質(zhì)性為基礎(chǔ)的血管功能性分子標(biāo)記物不斷開發(fā)，使以腫瘤新生血管為靶點(diǎn)的腫瘤分子成像成為可能?，F(xiàn)有的超聲造影劑粒徑多在1-8um左右，診斷條件下難以透過血管壁的細(xì)胞間隙進(jìn)入組織間質(zhì)，是真正意義上的血池造影劑，與其它在分子水平用于評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的影像學(xué)方法如CT、MRI，PET等比較，無造影劑外滲致背景信號(hào)增高的

2、缺陷，造影增強(qiáng)信號(hào)完全來自于腫瘤血管床，同時(shí)超聲技術(shù)具有較好的空間分辨率和實(shí)時(shí)顯像功能，操作簡便，無輻射損傷，更適合用于腫瘤血管生成的研究。
　　 研究表明，在實(shí)體瘤發(fā)生的早期階段已有血管生成開關(guān)的啟動(dòng)。KDR作為最重要的血管生長因子VEGF的主要受體，介導(dǎo)VEGF的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管通透性增加等促血管生成活性，在腫瘤血管生成過程尤其是早期階段起著關(guān)鍵作用。本課題組前期的研究證實(shí)從人正常乳腺-單純?cè)錾?非典型增生-乳腺原位

3、癌-乳腺浸潤性癌這一發(fā)生與演進(jìn)過程中，KDR表達(dá)逐漸增高增強(qiáng)，尤其在乳腺原位癌及乳腺浸潤性癌的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈持續(xù)高表達(dá)，表明以KDR為靶點(diǎn)進(jìn)行乳腺癌新生血管分子顯像可能為乳腺癌的早期診斷提供新的思路。KDR高表達(dá)于乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多種腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示KDR可能成為多種實(shí)體瘤新生血管特異性分子顯像的靶標(biāo)并用于評(píng)價(jià)腫瘤血管生成狀態(tài)，估測預(yù)后及進(jìn)一步用于抗血管生成治療療效監(jiān)測。
　　 靶向

4、超聲分子顯像在血栓、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化以及腫瘤新生血管的評(píng)價(jià)方面已取得初步成果。目前與超聲微泡連接用于超聲分子顯像的配體主要以抗體居多，抗體與靶細(xì)胞表面抗原結(jié)合特異性強(qiáng)，但抗體明顯的免疫原性，分子量過大，受其表面修飾位點(diǎn)限制顯像靈敏度不夠高的缺陷限制了以抗體為導(dǎo)向分子的靶向造影劑在體內(nèi)應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們選擇分子量小，與靶點(diǎn)結(jié)合特異性強(qiáng)的短肽作為與超聲造影劑結(jié)合的配體，將從噬菌體肽庫中篩選到的與KDR有高親和活性的12肽K237通過

5、生物素-親和素橋與脂質(zhì)體微泡偶連，構(gòu)建靶向微泡，體外實(shí)驗(yàn)鑒定其生物活性，同時(shí)建立裸鼠移植瘤模型進(jìn)行超聲造影顯像，探討以KDR為靶點(diǎn)進(jìn)行乳腺癌新生血管分子靶向超聲顯像的可行性。
　　 材料與方法:
　　 1.短肽的合成
　　 參照文獻(xiàn)方法固相合成與KDR有高親和活性的氨基酸序列為(HTMYYHHYQHHL)的生物素化十二肽以及含隨機(jī)序列的對(duì)照肽，高效液相色譜法測定化學(xué)純度，柱層析法進(jìn)行純化分離，收集主峰進(jìn)行質(zhì)譜分析

6、。
　　 2.DiI紅色熒光標(biāo)記的靶向微泡的制備
　　 按摩爾比稱取一定量的DSPC、DPPE-Biot于三頸瓶中，并加入DiI染料、PEG4000、泊洛沙姆(F188)，加25ml蒸餾水，于70℃水浴攪拌30min，放冷至室溫。把制好的脂質(zhì)混懸液加入50ml聚丙烯管內(nèi)，將剪切刀頭插至液面下，通入全氟丙烷2min氣體，以一定的剪切速度剪切一定時(shí)間，制得包裹全氟丙烷氣體的脂質(zhì)微泡，分裝于西林瓶中充入全氟丙烷氣體密閉，制備得

7、到生物素化DiI紅色熒光標(biāo)記的脂質(zhì)微泡。生物素化脂質(zhì)微泡加入鏈親和素，冰上孵育30min，純化洗滌后再分別加入生物素化12肽或含隨機(jī)序列的對(duì)照肽，冰上孵育30min，洗滌純化后即制備出靶向微泡(MBp)和對(duì)照微泡(MBc)，4℃冰箱保存。
　　 3.靶向微泡理化性質(zhì)鑒定
　　 同上述步驟制備生物素化的DiI紅色熒光標(biāo)記的普通微泡，加入鏈親和素，洗滌純化后加入FITC標(biāo)記的生物素化12肽，冰上孵育30min，洗滌純化后即制

8、備出FITC標(biāo)記的靶向微泡(FITC-MBp)。庫爾特計(jì)數(shù)儀進(jìn)行粒度分析，光鏡及熒光顯微鏡觀察微泡形態(tài)、熒光分布，熒光顯微鏡下觀察FITC綠色熒光標(biāo)記的小肽與DiI紅色熒光標(biāo)記的微泡的連接情況。
　　 4.靶向微泡體外靶向試驗(yàn)
　　 4.1.體外靶向試驗(yàn):細(xì)胞免疫熒光及WesternBlot檢測人結(jié)腸癌癌LOVO細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、人結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞KDR表達(dá)情況，DiI標(biāo)記的靶向微泡(MBp)

9、及DiI標(biāo)記的對(duì)照微泡(MBc)分別與三種細(xì)胞孵育30min，DAPI染核后，普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察微泡與三種細(xì)胞的粘附情況，取10個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞周圍粘附的微泡數(shù)量，比較三種細(xì)胞周圍粘附的微泡數(shù)量的差異。
　　 4.2.阻斷試驗(yàn):將一定量的K237與LOVO細(xì)胞孵育30min后滴加DiI標(biāo)記的靶向微泡(MBp)，DAPI染核后，普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察微泡與LOVO細(xì)胞的粘附情況，取10個(gè)隨機(jī)視野，

10、計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞周圍粘附的微泡數(shù)量，并與未封閉組比較有無差異。
　　 4.3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示。三種細(xì)胞與靶向微泡之間的粘附情況選用近似F檢驗(yàn)Welch法進(jìn)行方差分析;組間多重比較采用DunnetT3檢驗(yàn)。LOVO細(xì)胞靶向微泡與對(duì)照微泡之間采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);LOVO細(xì)胞靶向組與阻斷組微泡粘附數(shù)量比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。
　　 5.動(dòng)物模

11、型的建立收集處于對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞、LS174T細(xì)胞（培養(yǎng)于含10％血清的1640培養(yǎng)基，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)）制成濃度為5.0x107/ml的細(xì)胞懸液。6-8周齡雌性裸鼠36只，隨機(jī)選取18只注射MDA-MB-231細(xì)胞，余注射LS174T細(xì)胞。每鼠無菌條件下局部消毒，于裸鼠皮下第三對(duì)乳腺脂肪墊處緩慢注射0.1ml的細(xì)胞懸液，見局部形成隆丘后退針，定期觀察腫瘤生長情況。
　　 6.動(dòng)物體內(nèi)超聲造影成像及

12、對(duì)比圖像分析
　　 6.1.實(shí)驗(yàn)分組:36只移植瘤模型裸鼠分為兩組，MDA-MB-231、LS174T移植瘤模型各18只;兩組移植瘤模型裸鼠各組隨機(jī)選12只移植瘤模型行靶向微泡超聲造影檢查，各組余6只小肽預(yù)先封閉后再行靶向微泡超聲造影檢查。
　　 6.2.靶向超聲造影實(shí)驗(yàn):取MDA-MB-231、LS174T移植瘤裸鼠各12只，10天后行MBp和MBc超聲造影檢查。麻醉后裸鼠仰臥位固定于自制平臺(tái)上。將探頭放于支架上并調(diào)整

13、探頭使腫瘤能夠良好顯像。CEU檢查選用采用二次諧波成像（secondharmonicimaging）技術(shù)進(jìn)行，探頭發(fā)射頻率為10.0MHz，接收頻率為14MHz機(jī)械指數(shù)(MechanicalIndex，MI)為0.14，實(shí)驗(yàn)過程中各項(xiàng)參數(shù)及探頭位置保持不變。所有裸鼠經(jīng)尾靜脈分別隨機(jī)注射0.2ml濃度為2.0x108/ml的靶向微泡、對(duì)照微泡(時(shí)間間隔為30min)。注入微泡5min后獲取腫瘤聲學(xué)造影第一幀圖像，此后，以高M(jìn)I(1.9)連

14、續(xù)超聲發(fā)射2～3s破壞微泡后，繼續(xù)存儲(chǔ)圖像3-4幀。全部聲學(xué)造影圖像存于DVD盤，以備脫機(jī)分析。
　　 6.3.小肽阻斷試驗(yàn):兩組瘤鼠各6只，以0.2mlK237小肽預(yù)先注射30min后再注射2.0(×)108/ml靶向微泡0.2ml，造影方法及圖像處理同前。
　　 6.4.圖像分析:應(yīng)用MCE軟件對(duì)超聲圖像進(jìn)行分析，測量實(shí)驗(yàn)裸鼠腫瘤顯影各個(gè)圖像的聲強(qiáng)度(videointensity,(Ⅵ))，其中第一幀圖像的聲強(qiáng)度值代

15、表微泡在組織及循環(huán)中的總濃度，包括腫瘤組織的粘附和體內(nèi)血液循環(huán)的微泡，高機(jī)械指數(shù)超聲波破壞后的聲強(qiáng)度值為血液循環(huán)中的微泡濃度，前者減去后者即得到粘附在腫瘤組織中的微泡濃度。采用彩色編碼技術(shù)制作腫瘤組織及周邊組織彩色編碼圖像。
　　 6.5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示。腫瘤組織內(nèi)靶向微泡、對(duì)照組微泡、阻斷組(Ⅵ)值比較均采用One-WayANOVA，方差不齊則選用近似F檢

16、驗(yàn)Welch法進(jìn)行方差分析;組間多重比較方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用DunnetT3檢驗(yàn)。
　　 7.動(dòng)物活體熒光成像
　　 所有裸鼠行超聲造影后次日進(jìn)行活體熒光成像。裸鼠以4％的戊巴比妥鈉0.2ml腹腔麻醉。麻醉后裸鼠仰臥位固定于自制平臺(tái)上，隨機(jī)選取24只（兩組腫瘤各12只）分別經(jīng)尾靜脈注入DiI熒光標(biāo)記的靶向微泡MBp、對(duì)照微泡MBc，余裸鼠則以K237小肽封閉30min后再注射DiI熒光標(biāo)記的靶向微泡MBp

17、，微泡劑量、濃度及時(shí)間間隔同超聲造影。注入微泡后，采用KODAKImageStation4000MMDigital系統(tǒng)，采用549nm的激發(fā)光，發(fā)射波長為564nm，觀察各組微泡在腫瘤部位的粘附情況。
　　 8.腫瘤組織免疫組化分析
　　 處死裸鼠，取出裸鼠腫瘤組織及瘤周正常組織，4％多聚甲醛固定，行免疫組化檢查，檢測組織內(nèi)KDR表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.高效液相色譜及質(zhì)譜分析:合成肽高效液相色

18、譜分析主峰測定值為2522.9D，與理論分子量2523.6D基本符合，主峰含量約98.5％，合成成功。
　　 2.超聲微泡理化性質(zhì):制備得到的靶向脂質(zhì)體微泡(MBp)和對(duì)照微泡(MBc)普通光鏡下觀察分布均勻，無聚集現(xiàn)象，單個(gè)微泡外觀圓整。庫爾特計(jì)數(shù)儀測得MBp濃度約為(5.17±1.0)x108個(gè)/ml，粒徑為（2.01±0.93）μm，MBc濃度約為(5.37±1.07)x108個(gè)/ml，粒徑為（2.10±1.03）μm。熒

19、光顯微鏡下見FITC標(biāo)記的靶向微泡(FITC-MBp)外殼發(fā)出明亮的黃色熒光，表明熒光標(biāo)記的小肽與DiI標(biāo)記的微泡外殼連接良好。
　　 3.靶向微泡體外性能鑒定
　　 3.1.結(jié)合試驗(yàn):細(xì)胞免疫熒光及WesternBlot結(jié)果顯示，LOVO細(xì)胞呈KDR強(qiáng)陽性表達(dá)，MDA-MB-231細(xì)胞呈KDR陽性表達(dá)，LS174T細(xì)胞呈KDR陰性表達(dá)。光鏡下見LOVO細(xì)胞周圍較多靶向微泡粘附，熒光顯微鏡下LOVO細(xì)胞核發(fā)出明亮的藍(lán)色熒

20、光，細(xì)胞周圍見較多紅色熒光的靶向微泡粘附;光鏡下MDA-MB-231細(xì)胞周圍見部分靶向微泡粘附，熒光顯微鏡下MDA-MB-231細(xì)胞核發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，細(xì)胞周圍可見部分紅色靶向微泡粘附;LS174T細(xì)胞周圍未見明顯紅色靶向微泡粘附;對(duì)照微泡在三組細(xì)胞粘附量極少，未見明顯紅色微泡粘附。
　　 3.2.阻斷試驗(yàn):普通光鏡下，預(yù)先以K237小肽封閉的LOVO細(xì)胞周圍靶向微泡粘附數(shù)量較未封閉組明顯減少，熒光顯微鏡下見LOVO細(xì)胞周圍紅

21、色熒光強(qiáng)度明顯減弱。
　　 3.3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:三種細(xì)胞粘附靶向微泡數(shù)量之間比較有顯著性差異(P=0.000);LOVO細(xì)胞周圍粘附的MBp數(shù)目高于MDA-MB-231（19.12±2.83、9.64±2.67，P=0.000）;LOVO細(xì)胞周圍粘附的MBp數(shù)目明顯高于LS174T細(xì)胞周圍粘附的MBp（19.12±2.83、0.30±0.23，P=0.000）;LOVO細(xì)胞周圍粘附的MBp明顯高于MBc（19.12±2.83、0

22、.16±0.15，P=0.000）。小肽預(yù)先封閉后，LOVO周圍細(xì)胞靶向微泡粘附數(shù)量與未封閉組靶向微泡的粘附數(shù)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(3.22±2.24、19.12±2.83,P=0.000)。
　　 4.動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 4.1.動(dòng)物模型制備:10天后，36只裸鼠均于注射部位形成肉眼可見的實(shí)體瘤，瘤體直徑0.4-0.8cm，平均直徑0.6cm，腫塊邊緣不規(guī)則，表皮完好，無破潰出血。
　　 4.2.超聲造影及圖像分析:

23、超聲造影彩色編碼顯示，MDA-MB-231腫瘤組，MBp在腫瘤組織內(nèi)部的彩色編碼圖像顯示腫瘤組織超聲顯影顯著不均勻增強(qiáng)，而MBc在腫瘤組織彩色編碼圖像見輕度超聲顯影，K237小肽封閉后MBp在腫瘤組織彩色編碼圖像見輕度超聲顯影;LS174T組，MBp在腫瘤組織內(nèi)部的彩色編碼圖像顯示腫瘤組織超聲顯影顯著不均勻增強(qiáng)，而MBc在腫瘤組織彩色編碼圖像見輕度超聲顯影，K237小肽封閉后MBp在腫瘤組織彩色編碼圖像見輕度超聲顯影。
　　 4

24、.3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:MDA-MB-231腫瘤組，靶向微泡組在腫瘤組織的(Ⅵ)值與對(duì)照微泡在腫瘤組織的(Ⅵ)值比較有顯著性差異(38.11±11.75、12.52±5.23，P=0.000)，靶向微泡組聲強(qiáng)度值約為對(duì)照微泡組3倍;K237預(yù)先封閉組聲強(qiáng)度值與未封閉組相比有顯著性差異（13.77±4.35、38.11±11.75，P=0.000）。LS174T腫瘤組，靶向微泡組(Ⅵ)值與對(duì)照微泡(Ⅵ)值比較有顯著性差異(30.18±9.56、

25、8.28±4.74，P=0.000)，靶向微泡組約為對(duì)照組的3.6倍，K237預(yù)先封閉組聲強(qiáng)度值與未封閉組有顯著差異(9.23±3.44、30.18±9.56，P=0.000)。
　　 5.動(dòng)物體內(nèi)活體熒光成像:兩組荷瘤裸鼠注射熒光標(biāo)記的MBp后6-10分鐘可在腫瘤部位顯示局部明亮的紅色熒光，注射熒光標(biāo)記的對(duì)照微泡及小肽K237預(yù)先注射封閉30min后再注射熒光標(biāo)記的靶向微泡，兩種腫瘤部位均未見局部紅色熒光出現(xiàn)。
　　

26、6.免疫組化:免疫組化檢查顯示，MDA-MB-231腫瘤組織內(nèi)部見較多量新生血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞棕色著色，KDR陽性表達(dá)，LS174T腫瘤組織邊緣見新生血管內(nèi)皮細(xì)胞棕色著色，KDR陽性表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.制備得到的以KDR為靶點(diǎn)的靶向微泡在體外具有與靶細(xì)胞結(jié)合的高度特異性。
　　 2.腫瘤靶向顯像效果是通過小肽與腫瘤組織內(nèi)新生血管內(nèi)皮特異性地結(jié)合而促使靶向微泡粘附于腫瘤血管床實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.