基于VEGFR靶點(diǎn)的腫瘤靶向抑制肽的改造、篩選及鑒定.pdf

1、研究背景及目的
　　 腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移均依賴于血管生成，抗腫瘤血管生成具有良好的應(yīng)用前景。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF為最主要的血管生成促進(jìn)因子，它通過(guò)與胞膜上的VEGF受體(VEGFR)特異結(jié)合而發(fā)揮促血管生成作用，其中VEGFR-1(Flt-1)及VEGFR-2(KDR)高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞及新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在其它細(xì)胞中極低表達(dá)或不表達(dá)，在腫瘤血管生成中處于核心地位，與腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，阻斷VEGFR的功能可抑

2、制VEGF的促血管生成作用。因此，以VEGF/VEGFR為靶點(diǎn)開展的抗腫瘤血管生成研究成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。
　　 VEGF125-136為VEGF-A外顯子6編碼的12肽QKRKRKKSRYKS，能與VEGFR特異結(jié)合但不激活VEGFR，對(duì)VEGFR起封閉作用，從而競(jìng)爭(zhēng)抑制VEGF的促血管生成，有望作為腫瘤核素靶向顯像或核素治療的侯選分子。
　　 上一國(guó)家自然科學(xué)基金課題(30400114)結(jié)果提示：①188Re-V

3、EGF125-136明顯靶向聚集于荷瘤裸鼠的腫瘤組織，抑制腫瘤生長(zhǎng)；②腫瘤組織轉(zhuǎn)染截短KDR基因后，明顯增加了188Re-VEGF125-136在腫瘤部位的聚集量。即該標(biāo)記物在腫瘤的靶向顯像及治療方面具有較好的應(yīng)用前景，但它在腫瘤組織的滯留時(shí)間僅3小時(shí)。
　　 進(jìn)一步提高標(biāo)記物在腫瘤組織的聚積量(提高瘤/非瘤比值)與滯留時(shí)間，以增強(qiáng)抗腫瘤作用為本研究需要深入探討的重點(diǎn)。提高多肽與受體間的親和力是提高標(biāo)記物在腫瘤組織聚積量與滯留時(shí)

4、間的有效途徑。配體與受體結(jié)合的可逆性是受體的最基本特性之一，而親和力是衡量配體-受體結(jié)合能力及穩(wěn)定性的重要參數(shù)：親和力越高，配體與受體越易結(jié)合，結(jié)合之后的復(fù)合物越穩(wěn)定，不易發(fā)生解離。
　　 本研究旨在探討VEGF125-136的改造及篩選目標(biāo)多肽的方法，然后對(duì)目標(biāo)多肽的99Tcm標(biāo)記方法探討，標(biāo)記多肽在荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布及SPECT腫瘤靶向顯像，為進(jìn)一步的腫瘤靶向顯像及靶向治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 研究方法
　　

5、 1.多肽VEGF125-136的生物信息學(xué)改造：結(jié)合分子對(duì)接法及表面基團(tuán)相互作用法對(duì)VEGF125-136進(jìn)行改造，獲得理論上與VEGFR間具有更高親和力的多肽。
　　 2.體外受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證多肽與VEGFR的親和力，3H-TdR參入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，從上述多條多肽中篩選得到目標(biāo)多肽。
　　 3.目標(biāo)多肽的放射性核素標(biāo)記及鑒定：選用合適的雙功能螯合劑偶聯(lián)多肽，探討目標(biāo)多肽的最佳標(biāo)記條件，紙層析法和

6、HPLC法鑒定多肽的標(biāo)記率、放射化學(xué)純度及體外穩(wěn)定性。半胱氨酸置換實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證99Tcm與多肽的螯合能力。體外受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定標(biāo)記多肽的體外受體結(jié)合活性。
　　 4.標(biāo)記多肽的藥代動(dòng)力學(xué)研究：取日本大耳兔8只，每只經(jīng)左耳緣靜脈注射1mCi/200μl標(biāo)記多肽，分別于注射后1.5、3、5、10、30、60、120、240、480min從右耳緣靜脈抽血測(cè)量血樣放射性濃度，應(yīng)用藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析軟件(DAS3.0)分析多肽最佳方式模型

7、及示蹤動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　 5.標(biāo)記多肽在正常昆明小鼠體內(nèi)分布研究：15只昆明小鼠經(jīng)尾靜脈注射標(biāo)記溶液7.4MBq/200μl，分別于30min、1h、2h摘眼球法收集血液并將小鼠頸椎脫臼法處死，收集心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、甲狀腺、骨、肌肉，分別稱重并測(cè)放射性，經(jīng)參考源校正后計(jì)算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。
　　 6.日本大耳白兔顯像研究：耳緣靜脈注射標(biāo)記溶液0.5mCi后立即以1幀/min采集60min

8、，并于90、120、180、240min預(yù)置計(jì)時(shí)5min采集圖像一幀，觀察各器官的放射性分布動(dòng)態(tài)變化。
　　 7.標(biāo)記多肽在荷瘤裸鼠體內(nèi)顯像及競(jìng)爭(zhēng)抑制顯像研究：荷瘤裸鼠注射標(biāo)記目標(biāo)多肽物(11.1MBq/只)后0.5h、1 h、1.5h、2h、3h、4h行SPECT平面預(yù)置計(jì)時(shí)(10 min)顯像。注射目標(biāo)多肽1mg后注射標(biāo)記目標(biāo)多肽物(11.1MBq/只)，0.5h、1h行SPECT平面預(yù)置計(jì)時(shí)(10 min)顯像，評(píng)價(jià)目標(biāo)多

9、肽與腫瘤組織結(jié)合的特異性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.生物信息學(xué)方法改造VEGF125-136并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獲得了兩條與VEGFR受體親和力高且可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖的多肽：QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS。
　　 2.目標(biāo)多肽的放射性核素標(biāo)記及鑒定：目標(biāo)多肽選用HYNIC為雙功能螯合劑，標(biāo)記方法如下：在2ml細(xì)胞凍存管中依次加入20μg多肽，HYNIC-QKRKRKKSRKKH50mg

10、Tricine，HYNIC-RKRKRKKSRYIVLS為80mgTricine，5mg TPPTS，100μL0.25mmol/L琥珀酸緩沖溶液(pH=5)，100μL Na99TcmO4185MBq，總體積200μL，充氮密封后100℃反應(yīng)25min，自然冷卻至室溫。
　　 經(jīng)雙功能螯合劑HYNIC偶聯(lián)后的多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS，標(biāo)記率均>(94.13±1.77)。室溫下放置24h后，放化

11、純度仍高達(dá)90%。兩條多肽經(jīng)HYNIC修飾后抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力與修飾前無(wú)明顯差異。
　　 兩條多肽經(jīng)HYNIC修飾并經(jīng)99Tcm標(biāo)記后仍保持了良好的受體結(jié)合活性，能與靶細(xì)胞特異結(jié)合。
　　 3.99Tcm-HYNIC-QKRKRKKSRKKH在正常日本大耳兔體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合三室模型。99Tcm-HYNIC-RKRKRKKSRYIVLS在正常日本大耳兔體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合二室模型。
　　 4.

12、正常昆明小鼠體內(nèi)分布及日本大耳白兔體內(nèi)顯像示：兩條多肽具有親水性，主要通過(guò)腎臟經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄，血流清除快，在心、肝、脾、肺、腦、胃腸、甲狀腺、骨、肌肉等組織器官中分布較少。
　　 5.荷瘤裸鼠體內(nèi)顯像示：尾靜脈注射標(biāo)記多肽后0.5h，腫瘤部位即可見明顯放射性濃聚，雙腎、膀胱可見明顯的放射性濃聚，而心臟、肺臟、肝臟、胃腸道、腦、頸部及肌肉組織均未見明顯放射性分布。競(jìng)爭(zhēng)抑制顯像腫瘤部位未見明顯放射性濃聚。
　　 結(jié)論