急性缺血腦組織靶向肽的篩選、鑒定及分子成像研究.pdf

1、急性缺血性腦卒中能夠引發(fā)大腦神經(jīng)組織的一系列應(yīng)激反應(yīng)，包括酸中毒、興奮性氨基酸釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基釋放、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，這些應(yīng)激反應(yīng)的進(jìn)展通常反應(yīng)腦卒中的病理進(jìn)程。準(zhǔn)確評(píng)價(jià)腦缺血后某一時(shí)期應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)其定位、定性、定量及可視化，對(duì)于評(píng)估腦損傷與修復(fù)、指導(dǎo)腦卒中的個(gè)體化治療和預(yù)測(cè)病人預(yù)后具有重要的意義。分子影像技術(shù)能夠通過(guò)特異性的分子探針從活細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)特定分子的可視化和定量研究，可用于腦缺血后病理進(jìn)程的監(jiān)測(cè)。但現(xiàn)有的可

2、用于腦卒中分子成像的特異性分子探針報(bào)道并不多見(jiàn)，限制了分子影像技術(shù)的應(yīng)用。本研究通過(guò)噬菌體展示肽庫(kù)體內(nèi)篩選技術(shù)，以期獲得能夠靶向缺血腦組織的多肽，并構(gòu)建分子探針，初步實(shí)現(xiàn)缺血腦卒中的分子成像，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、急性缺血腦組織靶向分子的體內(nèi)篩選
　　通過(guò)線栓法構(gòu)建小鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型，模擬人類急性缺血性腦卒中。通過(guò)噬菌體展示七肽庫(kù)對(duì)MCAO小鼠進(jìn)行體內(nèi)篩選，經(jīng)四輪篩選后噬菌體克隆在MCAO小鼠缺血側(cè)

3、腦組織的密度較第一輪篩選時(shí)富集了10.4倍。從第四輪篩選所回收噬菌體克隆中隨機(jī)挑選120個(gè)分隔良好的藍(lán)色噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)后，提取DNA測(cè)序，最終成功測(cè)序106個(gè)噬菌體克隆，共得到17種序列，其中多肽序列HGGVRLY出現(xiàn)頻次最高，占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，將其命名為HGG肽，展示有該肽的噬菌體克隆命名為HGG-M13噬菌體，作為候選噬菌體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、HGG-M13噬菌體肽及HGG肽靶向缺血腦組織的特異性鑒定
　　本研究首先

4、從HGG-M13噬菌體的角度，通過(guò)噬菌體體內(nèi)回輸實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定HGG-M13噬菌體能夠靶向缺血腦組織，而且這種靶向性依賴于噬菌體表面展示的HGG肽而不是噬菌體自身的骨架蛋白;免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HGG-M13噬菌體與缺血腦組織中部分神經(jīng)元共定位。
　　隨后，分別采用5-TAMRA和FITC兩種熒光基團(tuán)修飾HGG肽，并注射至MCAO小鼠體內(nèi)，HGG熒光肽主要集中在缺血側(cè)腦組織，與HGG-M13噬菌體結(jié)果相一致，再次提示H

5、GG肽能夠靶向缺血腦組織。此外，通過(guò)體外培養(yǎng)神經(jīng)元，構(gòu)建氧糖剝奪模型，并用HGG熒光肽與之孵育，結(jié)果提示HGG熒光肽能夠與氧糖剝奪后的神經(jīng)元結(jié)合。
　　3、基于HGG肽構(gòu)建急性腦缺血靶向分子探針及初步分子成像
　　在EDC/Sulfa-NHS活化下，HGG肽上的氨基與錳鋅鐵氧體納米顆粒表面所攜帶的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)，使得錳鋅鐵氧體納米顆粒表面修飾HGG肽，從而構(gòu)建得到分子探針，并對(duì)其表征:電鏡尺寸大小為15.17 nm，水合粒

6、徑為53.98 nm，r2弛豫率為382.45mM-1S-1。將該分子探針注射至MCAO小鼠體內(nèi)，通過(guò)磁共振成像檢測(cè)到該分子探針的信號(hào)主要聚集在大腦缺血側(cè)，而未經(jīng)HGG肽修飾的錳鋅鐵氧體對(duì)照探針則無(wú)信號(hào)。
　　綜上所述，本研究通過(guò)噬菌體展示肽庫(kù)篩選技術(shù)對(duì)MCAO小鼠進(jìn)行體內(nèi)篩選，得到能夠靶向缺血腦組織的HGG肽，并初步鑒定了該肽的靶細(xì)胞為缺血狀態(tài)下的神經(jīng)元?；谠撾臉?gòu)建了磁共振成像分子探針，磁共振成像顯示該分子探針能夠在MCAO小