腦組織PPARγ靶基因篩選.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子是一種重要的DNA結(jié)合蛋白(DNA-binding protein)，與染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子、表觀遺傳調(diào)控子共同作用在細(xì)胞基因重編程中發(fā)揮著重要作用，調(diào)節(jié)著細(xì)胞增殖、分化、衰老和生死的命運(yùn)，和細(xì)胞再生以及腫瘤形成密切相關(guān)。由于轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞生命活動(dòng)中所處的重要位置，所以研究它有著重要的實(shí)際意義和價(jià)值。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ)是

2、一種配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子，為過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)家族成員之一，其另外兩個(gè)亞基分別是PPARα和PPARβ/δ。起初研究者認(rèn)為PPARγ只存在于脂肪組織中，參與糖脂能量代謝調(diào)節(jié)，增強(qiáng)胰島素敏感性，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。后有研究者發(fā)現(xiàn)PPARγ在大鼠脾臟以及人巨噬細(xì)胞和骨髓前體細(xì)胞中也有分布并參與抑制炎癥反應(yīng)。近年來，神經(jīng)生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)在胚胎腦

3、組織及神經(jīng)干細(xì)胞中PPARγ也大量存在并具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的功能，更有趣的是，盡管PPARγ在成年腦組織中表達(dá)量很低，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，其表達(dá)量顯著升高，這一發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)提示我們PPARγ在神經(jīng)形成、神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)損傷后修復(fù)中可能起著重要作用。實(shí)際上目前已有大量研究表明PPARγ在中風(fēng)、脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病中具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 關(guān)于PPARγ神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制目前報(bào)道的有代謝紊亂糾正機(jī)制、抗炎、抗氧化、

4、抗凋亡機(jī)制以及促神經(jīng)再生機(jī)制。PPARγ通過調(diào)節(jié)脂連素(adiponectin)、胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme，IDE)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor，TNF-α）等因子活性，提高胰島素敏感性、增加葡萄糖利用率，糾正代謝紊亂;通過抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide s

5、ynthase，iNOS)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)等促炎癥因子以及膠質(zhì)細(xì)胞活性，減少炎癥因子產(chǎn)生;通過抑制NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)氧化酶活性以及促進(jìn)過氧化氫酶、SOD(superoxide dismutase)等抗氧化酶活性，減少自由基生成;通過激活PI-3K/PDK-1/Akt通路促進(jìn)Bad磷酸化，維持線粒體跨膜電位穩(wěn)定，

6、從而最終減輕因代謝紊亂、線粒體功能受損或炎癥反應(yīng)、自由基生成引起的神經(jīng)元和（或）神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷或凋亡。盡管已有研究表明PPARγ激動(dòng)劑在脊髓損傷模型中能夠促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，但具體調(diào)控機(jī)制不明。研究者們除了研究PPARγ神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制中的調(diào)節(jié)分子外，還對(duì)PPARγ的來源進(jìn)行了分析。由于神經(jīng)元內(nèi)PPARγ較少，所以以往研究常認(rèn)為是膠質(zhì)細(xì)胞來源的PPARγ發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用，然而近年來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元PPARγ條件性敲除小鼠的腦組織對(duì)缺

7、血缺氧的耐受性降低，說明神經(jīng)元來源的PPARγ同樣具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元PPARγ除了具有神經(jīng)保護(hù)作用外還參與神經(jīng)調(diào)節(jié)，例如PPARγ通過作用于HPA軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)控制機(jī)體對(duì)心理應(yīng)激反應(yīng)性，下丘腦內(nèi)PPARγ參與調(diào)節(jié)攝食和能量平衡等，然而其中的分子機(jī)制尚不清楚?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀，我們一方面致力于探尋神經(jīng)元PPARγ神經(jīng)保護(hù)作用的新機(jī)制，另一方面試圖發(fā)現(xiàn)PPARγ潛在的新功能。神經(jīng)保護(hù)作用新機(jī)制的研究主要

8、集中于找到與PPARγ有著直接關(guān)系，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)、增殖、分化、突起生長(zhǎng)、神經(jīng)形成的基因，而PPARγ潛在的新功能則主要集中于找到與神經(jīng)元信息傳遞關(guān)系密切，參與神經(jīng)調(diào)節(jié)的基因，以期為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療找到新的治療靶點(diǎn)。為了找到PPARγ可能調(diào)節(jié)的基因，我們實(shí)驗(yàn)首先利用芯片技術(shù)進(jìn)行高通量篩選。具體做法，取兩只成年C57/B6J小鼠，一只腹腔注射12mg/kg體重羅格列酮，另一只腹腔注射相同體積DMSO作為對(duì)照，分別作用12h后，取全腦組織

9、;同時(shí)另外再取兩只腦內(nèi)PPARγ條件性敲除[轉(zhuǎn)基因小鼠floxp PPARγ（PPARγfl/fl）與Nesin-Cre小鼠交配同窩出生的小鼠]小鼠，一只為對(duì)照小鼠，基因型為PPARγfl/flCre-/-，另一只為PPARγ敲除小鼠，基因型為PPARγfl/flCre+/-，不做任何處理，取全腦組織。每只小鼠腦組織一半送于芯片公司用于芯片實(shí)驗(yàn)，另一半存留提取RNA（做定量PCR用，以備用來驗(yàn)證芯片結(jié)果）。然后利用上海伯豪生物技術(shù)有限公

10、司SAS系統(tǒng)對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行分析，我們首先選擇了如下基因，與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖密切相關(guān)的胰島素受體底物-4（insulin receptor substrate-4，IRS-4），參與神經(jīng)元信息傳遞的重要神經(jīng)遞質(zhì)受體5-羥色按受體2C(serotoninreceptor2C，5-HTr2C)和γ-氨基丁酸受體α6(gamma-aminobutyric acid receptorsubunit alpha-6, GABRA6)。接下來我們?cè)谠?/p>

11、養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元中對(duì)PPARγ與IRS-4、GABRA6、5-HTr2C的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證。取懷孕17-18天SD胎鼠皮層神經(jīng)元，培養(yǎng)1周后，用10μM羅格列酮分別處理0h、1h、2h、4h、8h、24h。然后收集細(xì)胞提取RNA，利用RT-PCR技術(shù)對(duì)GABRA6 mRNA進(jìn)行定性分析，利用RT-QPCR技術(shù)對(duì)IRS-4 mRNA、5-HTr2C mRNA進(jìn)行定量分析。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅格列酮處理1h和2h時(shí)GABRA6 mRNA

12、水平有上升趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，至4h和8h時(shí)GABRA6 mRNA水平下降至基線水平，而處理24h時(shí)GABRA6 mRNA水平上升為未處理組的2.6倍(P=0.037)。RT-QPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅格列酮處理4h和24h組IRS-4 mRNA分別增高為未處理組的1.47倍(P=0.007)和2倍(P=0.019)。激動(dòng)劑各小時(shí)處理組5-HTr2C mRNA與未處理組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，活化PPARγ可能促進(jìn)GABRA6和

13、IRS-4表達(dá)，但還不能排除PPARγ對(duì)5-HTr2C沒有影響。接下來我們又在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)PPARγ與IRS-4、5-HTr2C之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行驗(yàn)證，與此同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還引入了另外三個(gè)基因一并進(jìn)行研究，他們分別是突觸結(jié)合蛋白-2（synaptotagmin2，Syt2）為主要的Ca2+傳感器，調(diào)節(jié)快速神經(jīng)遞質(zhì)釋放;叉頭框蛋白C2(forkhead box C2，F(xiàn)oxc2)是重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)與代謝、血管生成/再生及重塑相關(guān)基因的表達(dá)，

14、其突變與肥胖、先天畸形、腫瘤發(fā)生關(guān)系密切;基因周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase1，Chek1)為細(xì)胞周期檢測(cè)系統(tǒng)中的重要因子，維持基因組穩(wěn)定，具有抗凋亡作用，其異常表達(dá)與腫瘤形成密切相關(guān)。首先取成年雄性C57BL/6J小鼠6-10只，體重22-24g，隨機(jī)分成兩組，對(duì)照組(DMSO)和激動(dòng)劑組(RSG)，每組3-5只，激動(dòng)劑組腹腔注射12mg/kg體重的羅格列酮，作用12h，對(duì)照組給予等體積10％ DMSO。然后分離

15、皮層、海馬，分別提取RNA和蛋白質(zhì)，用于RT-QPCR實(shí)驗(yàn)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)。RT-QPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，皮層組織激動(dòng)劑組IRS-4 mRNA、5-HTr2C mRNA、Check1 mRNA表達(dá)分別上升40％、63％、28％(P＜0.001，P=0.006，P＜0.001)，F(xiàn)oxc2 mRNA表達(dá)下降41％(P＜0.001)，Syt2 mRNA表達(dá)量有下降趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;海馬組織激動(dòng)劑組Syt2 mRNA表達(dá)上升51.5％

16、(P=0.002)，F(xiàn)oxc2mRNA表達(dá)下降51％(P=0.013)，其它基因mRNA表達(dá)無差異。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皮層組織激動(dòng)劑組5-HTr2C蛋白水平較對(duì)照組上升25.8％，海馬組織激動(dòng)劑組5-HTr2C蛋白水平與對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因IRS-4抗體源性的限制，目前市場(chǎng)上用于實(shí)驗(yàn)的IRS-4抗體多為人源性或大鼠源的，小鼠源性的幾乎沒有，所以本實(shí)驗(yàn)中沒有得到IRS-4在小鼠皮層、海馬組織中免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)。Foxc2

17、、Syt2、Check1尚在繼續(xù)驗(yàn)證中，對(duì)其蛋白水平還未予以檢測(cè)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)說明PPARγ激動(dòng)劑促進(jìn)皮層內(nèi)IRS-4、5-HTr2C、Chek1和海馬內(nèi)Syt2表達(dá)，而抑制皮層和海馬內(nèi)Foxc2表達(dá)。
　　 為了說明腦內(nèi)PPARγ對(duì)備選基因的調(diào)控作用，我們利用腦內(nèi)PPARγ條件性敲除小鼠來研究腦內(nèi)PPARγ缺乏對(duì)IRS-4、5-HTr2C、Foxc2、Syt2、Check1表達(dá)的影響。首先我們從基因型、條件性敲除小鼠特異性包含Cr

18、e介導(dǎo)重組體PPARγ（Cre-mediate recombinant PPARγ）以及PPARγ mRNA在不同組織中的變化情況這三個(gè)方面對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因鑒定分析，然后根據(jù)鑒定結(jié)果取成年雄性轉(zhuǎn)基因小鼠6-10只，體重22-24g，分成對(duì)照組（PPARγfl/fl，fl/fl）和基因敲除組（brain PPARγ knockout，BKO）兩組，每組各3-5只，fl/fl組基因型為PPARγfl/flCre-/-，BKO組基因型為P

19、PARγfl/fllCre+/-。用RT-QPCR技術(shù)檢測(cè)PPARγ對(duì)IRS-4、5-HTr2C、Foxc2、Syt2、Checkl在基因水平上的影響，同時(shí)用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)PPARγ對(duì)5-HTr2C在蛋白水平上的影響。小鼠基因型檢測(cè)(PCR)結(jié)果可見，fl/fl小鼠在230bp處有特異性條帶，100bp處無條帶，說明PPARγfl/fl陽性、Cre陰性，基因型為PPARγfl/flCre-/-;BKO小鼠在230bp和100bp處均有

20、條帶，說明PPARγfl/fl、Cre均陽性，基因型為PPARγfl/flCre+/-。重組體PPARγ檢測(cè)(RT-PCR)結(jié)果可見，除了BKO小鼠腦組織（皮層、海馬）條帶在300和400bp處外，其余均在700bp處，說明重組體PPARγ特異性表達(dá)在腦組織中。PPARγ mRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果可見，BKO小鼠腦組織內(nèi)（包括皮層和海馬）PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，幾乎無法檢測(cè)到，和PPARγfl/fl(fl/fl)組

21、相比差異顯著(P＜0.001);肝組織中PPARγ mRNA表達(dá)量和PPARγfl/fl(fl/fl)組相比沒有差異，肌肉和脾臟組織中PPARγ mRNA表達(dá)量和PPARγfl/fl(fl/fl)組相比分別減少0.3倍和增加0.6倍。和腦組織PPARγ變化量相比，腦外組織PPARγ變化量微乎其微，說明腦內(nèi)PPARγ條件性敲除是成功的。各基因RT-QPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PPARγ條件性敲除小鼠皮層組織中IRS-4 mRNA、5-

22、HTr2C mRNA、Chek1 mRNA分別下降14％、45.5％、24％（P=0.04，P＜0.001，P=0.037），F(xiàn)oxc2 mRNA、Syt2 mRNA表達(dá)無差異。PPARγ條件性敲除小鼠海馬組織中IRS-4 mRNA、5-HTr2C mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)oxc2 mRNA、Chek1 mRNA表達(dá)分別上升為對(duì)照組的3.68倍和1.22倍(P=0.044，P=0.001)，Syt2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組

23、下降33％(P=0.023)。免疫印跡結(jié)果未檢測(cè)到PPARγ條件性敲除小鼠皮層和海馬組織中5-HTr2C蛋白水平發(fā)生變化。RT-QPCR結(jié)果說明PPARγ激動(dòng)劑促進(jìn)皮層內(nèi)IRS-4 mRNA、5-HTr2C mRNA、Chek1 mRNA和海馬內(nèi)Syt2表達(dá)以及抑制海馬內(nèi)Foxc2 mRNA表達(dá)是腦內(nèi)PPARγ依賴的。為了進(jìn)一步說明IRS-4、5-HTr2C、Foxc2、Syt2、Check1受腦內(nèi)PPARγ調(diào)節(jié)，我們接下來取成年雄性B

24、KO小鼠6-10只，體重22-24g，隨機(jī)分成兩組，對(duì)照組(DMSO)和激動(dòng)劑組(RSG)，每組3-5只，激動(dòng)劑組腹腔注射12mg/kg體重的羅格列酮，對(duì)照組給予等體積10％ DMSO，作用12h后，分離皮層、海馬，提取RNA，用于RT-QPCR實(shí)驗(yàn)。RT-QPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，皮層組織激動(dòng)劑組IRS-4 mRNA水平上升40％(P=0.016)，F(xiàn)oxc2 mRNA、Syt2 mRNA分別下降32.5％、61％(P=0.01

25、3， P＜0.001)，5-HTr2C mRNA、Check1 mRNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。海馬組織激動(dòng)劑組5-HTr2C mRNA、Foxc2 mRNA較對(duì)照組分別下降28％和80％(P=0.014,P＜0.001),IRS-4 mRNA、Syt2 mRNA、Check1 mRNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明PPARγ促進(jìn)皮層組織5-HTr2C、Check1和海馬組織Syt2表達(dá)是PPARγ完全依賴的，而對(duì)IRS-4、Foxc2的表達(dá)則有可能是和其它