腦保護新靶點的篩選及機制研究.pdf

1、卒中已經(jīng)成為威脅人類健康的第一大長期致殘因素及第二大致死因素。因此，對腦卒中的防治成為現(xiàn)代醫(yī)學領(lǐng)域亟待解決的重大難題。對于出血性卒中，尚無有效的治療藥物。對于缺血性卒中，目前只有重組溶組織蛋白酶tPA能減輕神經(jīng)損傷；但是由于其治療時間窗短、副作用大、適用人群少等局限，極大的限制了其臨床推廣使用。基礎(chǔ)研究證實，超過1000多種神經(jīng)保護藥物能減輕卒中后神經(jīng)損傷，然而大樣本的臨床試驗均以失敗告終。這給本就艱難的腦卒中研究蒙上了巨大的陰影，有關(guān)

2、卒中后腦損傷發(fā)生機制及干預(yù)措施的爭論也愈趨激烈。大量的研究證實，缺血、高壓氧等預(yù)處理措施可誘導(dǎo)內(nèi)源性保護機制而發(fā)揮神經(jīng)保護效應(yīng)。與傳統(tǒng)的抑制單一病理進程的干預(yù)方法相比，基于內(nèi)源性保護機制的干預(yù)措施具有副作用小、效果持久、作用靶點多等優(yōu)點。因此，Lancet、Nature Neuscience等雜志紛紛撰文，認為闡明內(nèi)源性保護機制、開發(fā)基于內(nèi)源性保護通路的干預(yù)措施將為我們治療腦卒中提供新思路。
　　然而，在我們前期的大樣本研究中發(fā)現(xiàn)

3、一個重要問題，預(yù)處理措施并不能使所有動物或患者從中受益。為什么相同的預(yù)處理措施會產(chǎn)生不同的效應(yīng)？由于高壓氧預(yù)處理的機制遠未闡明，目前我們并不能合理解釋這一現(xiàn)象。因此，尋找預(yù)處理措施的關(guān)鍵效應(yīng)分子，闡明其作用機制，是高壓氧預(yù)處理廣泛應(yīng)用于臨床，進而進行基于內(nèi)源性保護機制的藥物開發(fā)必須解決的關(guān)鍵科學問題。
　　另一方面，由于缺血性和出血性卒中的治療措施截然不同，因此，臨床上區(qū)分卒中的類型顯得至關(guān)重要。然而，卒中類型區(qū)分，需要依賴于CT

4、以及MRI(核磁共振)掃描結(jié)果,而這些影像學檢查結(jié)果往往需要幾十分鐘，甚至數(shù)小時，這就錯過了救治病人的黃金治療時間。結(jié)合臨床研究及動物實驗深入分析發(fā)現(xiàn)，很多臨床試驗失敗并不僅僅由于藥物無效，更多的是在臨床試驗中，我們所給藥物由于依賴CT及MRI等影像學檢查而導(dǎo)致治療延遲。因此，開發(fā)能夠同時治療缺血及出血性腦卒中的藥物，在卒中癥狀出現(xiàn)早期即給予干預(yù)，成為未來治療卒中的重要研究方向。
　　因此，本課題一方面借助高通量蛋白質(zhì)組學技術(shù)，篩

5、選高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)神經(jīng)保護的效應(yīng)分子，闡明其作用機制，并根據(jù)效應(yīng)分子尋找基于內(nèi)源性保護機制的治療靶點。另一方面，通過文獻回顧，尋找缺血及出血性卒中神經(jīng)損傷過程中的共同信號通路，尋找治療靶點，以期能夠同時治療缺血及出血性卒中。
　　第一部分、高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的效應(yīng)分子篩選及機制研究
　　實驗一、采用蛋白質(zhì)組學方法篩選高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的效應(yīng)分子
　　目的：
　　1、篩選高壓氧預(yù)處理腦保護作用的內(nèi)源

6、性效應(yīng)分子。
　　2、確定效應(yīng)分子對腦缺血再灌注損傷的的神經(jīng)保護作用。
　　方法：首先，采用核磁共振連續(xù)動態(tài)掃面的方法，檢測高壓氧預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護效應(yīng)的時效性。建立大鼠局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型，采用亞組分析方法，將高壓氧預(yù)處理后的動物，通過術(shù)后腦梗死容積進行逆向分組，分為預(yù)處理有效組和預(yù)處理無效組。隨后，采用同位素標記相對與絕對定量（iTRAQ）技術(shù)，進行差異蛋白篩選。采用Western Blot

7、及ELISA技術(shù)，對篩選到的潛在效應(yīng)分子進行逐一驗證。為了進一步明確效應(yīng)分子的神經(jīng)保護效應(yīng)，采用siRNA側(cè)腦室微注射、基因敲除、給予外源性蛋白等方法進行驗證。
　　結(jié)果：高壓氧預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷大鼠具有長期保護效應(yīng)，能夠明顯改善缺血后28天的神經(jīng)功能；核磁共振結(jié)果顯示，在缺血損傷后28天，高壓氧預(yù)處理組大鼠的腦梗死體積明顯小于對照組。利用iTRAQ這一高通量蛋白質(zhì)組學技術(shù)，我們篩選到了Cystatin C, Dkk3 pr

8、otein, Platelet factor4,Mannose-binding protein C(MBLC)等9種差異蛋白。采用ELISA及western-blot等方法，我們對這9種潛在效應(yīng)分子的準確性進行了逐一驗證。結(jié)果顯示，Cystatin C及MBLC兩種蛋白與篩選結(jié)果一致。高壓氧有效組血清Cystatin C濃度顯著高于對照組及無效組；有效組血清MBLC濃度顯著低于對照組及無效組。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清中Cystatin C與

9、腦損傷程度呈明顯的負相關(guān)，而MBLC濃度與腦損傷程度呈明顯的正相關(guān)。進一步研究顯示，高壓氧預(yù)處理后，腦組織中神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞中Cystatin C的表達也顯著升高。給予Cystatin C siRNA后，可部分逆轉(zhuǎn)高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)的腦保護效應(yīng)。而在Cystatin C基因敲除的大鼠中，高壓氧預(yù)處理的腦保護效應(yīng)消失。同時，外源性Cystatin C對缺血性腦損傷有明顯的治療效應(yīng)。
　　結(jié)論：本研究明確了高壓氧預(yù)處理能夠有效地減少

10、細胞死亡，從而改善腦缺血再灌注損傷大鼠的長期預(yù)后，而不是延緩細胞死亡進程。通過蛋白質(zhì)組學的高通量方法，我們篩選到Cystatin C是介導(dǎo)高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)的機體內(nèi)源性保護機制的關(guān)鍵效應(yīng)分子。這一研究將為高壓氧等非缺血預(yù)處理措施廣泛應(yīng)用于腦卒中的防治奠定科學基礎(chǔ)，同時也為以Cystatin C為靶點，開發(fā)治療缺血性腦卒中的藥物提供了新思路。
　　實驗二、Cystatin C通過保護溶酶體促進自噬介導(dǎo)高壓氧預(yù)處理的神經(jīng)保護效應(yīng)

11、　　目的：確定高壓氧預(yù)處理腦保護作用效應(yīng)分子--Cystatin C的作用機制。
　　方法：建立大鼠局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型，檢測缺血再灌注損傷后，Cystatin C在腦組織中表達的時程變化。并通過比較對照組和高壓氧預(yù)處理組，Cystatin C在缺血損傷后的表達差異，明確高壓氧預(yù)處理是否通過調(diào)控Cystatin C，影響缺血再灌注損傷的病理進程。同時，觀察分析Cystatin C的表達與自噬小體相關(guān)蛋白表達的相關(guān)性，

12、并借助Cystatin C的小干擾RNA調(diào)控Cystatin C的表達，探索Cystatin C與自噬相關(guān)蛋白的上下游關(guān)系。最后，采用免疫熒光、免疫電鏡技術(shù)及Cystatin C基因敲除大鼠，觀察溶酶體及自噬溶酶體的變化，明確高壓氧預(yù)處理是否通過上調(diào)Cystatin C保護溶酶體，促進自噬順利完成。
　　結(jié)果：缺血再灌注損傷后，半暗帶皮質(zhì)Cystatin C顯著升高；而高壓氧預(yù)處理可以使這一升高進一步加強。同時自噬小體相關(guān)蛋白的表

13、達也于缺血損傷后增加，高壓氧預(yù)處理可以促進缺血誘導(dǎo)的自噬小體相關(guān)蛋白上調(diào)。采用Cystatin C的小干擾RNA下調(diào)Cystatin C表達后，高壓氧預(yù)處理促進自噬小體相關(guān)蛋白表達的效應(yīng)消失。免疫熒光及免疫電鏡的結(jié)果表明，高壓氧預(yù)處理可以保護溶酶體的完整性，促進自噬小體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。而在Cystatin C基因敲除大鼠中，高壓氧預(yù)處理保護溶酶體完整性及促進自噬溶酶體形成的效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：高壓氧預(yù)處理通過同時

14、增加自噬小體的形成，保護溶酶體的完整性，促進自噬小體與溶酶體融合，從而保障自噬的順利進行，最終發(fā)揮其神經(jīng)保護效應(yīng)。作用機制的闡明，有助于高壓氧預(yù)處理臨床應(yīng)用的推廣。同時，實驗一第一部分結(jié)果已經(jīng)證明，外源性Cystatin C可以誘導(dǎo)與高壓氧預(yù)處理相同的神經(jīng)保護效應(yīng)，豐富了Cystatin C的生物學功能，有望將其作為靶點，進行藥物開發(fā)。
　　第二部分、缺血及出血性卒中共同信號通路治療新靶點的發(fā)現(xiàn)及機制研究
　　目的：尋找缺血

15、及出血性腦卒中的共同信號通路，并針對目標靶點，合成有效肽段，驗證其神經(jīng)保護作用及機制。
　　方法：通過文獻回顧，我們發(fā)現(xiàn)MD2-TLR4是缺血性卒中及出血性卒中共同信號通路中的關(guān)鍵靶點之一。在體外研究中，通過原代神經(jīng)元培養(yǎng)，用興奮毒性損傷模型模擬卒中的病理過程；通過Western blot及免疫熒光技術(shù)，明確MD2在興奮毒性損傷中的變化。根據(jù)MD2蛋白的生物學特性，分別合成能特異性干擾MD2功能及特異性降解MD2的短肽Tat-CI

16、RP和Tat-CIRP-CMA。采用免疫共沉淀技術(shù)，驗證合成肽段的生物學效應(yīng)，并探索其對興奮毒性損傷的保護作用。在體內(nèi)研究中，通過構(gòu)建局灶性缺血（MCAO）及顱內(nèi)出血模型，驗證MD2在這兩種病理狀態(tài)下的變化。通過神經(jīng)功能學評分、TTC染色和尼氏染色等方法對肽段的短期及長期保護效應(yīng)進行評估。最后，借助TLR4、MD2基因敲除小鼠，對MD2介導(dǎo)細胞死亡及Tat-CIRP誘導(dǎo)神經(jīng)保護的分子機制進行探索。
　　結(jié)果：在培養(yǎng)的原代神經(jīng)元中，

17、NDMA誘導(dǎo)的興奮毒性損傷，使MD2蛋白表達在受刺激后1小時后顯著升高。根據(jù)MD2蛋白的生物學功能，合成的可以穿過血腦屏障及細胞膜，并能干預(yù)MD2功能的短肽Tat-CIRP、Tat-CIRP-CMA能有效阻斷NMDA誘導(dǎo)的細胞死亡。此外，缺血再灌注損傷后，小鼠腦皮質(zhì)半暗帶MD2的表達于缺血再灌注損傷早期即明顯升高，并于再灌注后6小時達到峰值；MD2的高表達可持續(xù)至缺血后24小時。同時，MD2表達的升高可以發(fā)生于神經(jīng)元，而不僅僅局限于膠質(zhì)

18、細胞。在缺血損傷后3天及28天，Tat-CIRP能顯著改善小鼠的神經(jīng)功能，減少梗死體積。此外,出血性卒中也誘導(dǎo)MD2的表達升高，以MD2為干預(yù)靶點的Tat-CIRP，能顯著改善出血性卒中小鼠的遠期預(yù)后。機制研究表明，Tat-CIRP可以通過同時抑制凋亡及壞死性凋亡，從而產(chǎn)生保護效應(yīng)。但在TLR4基因敲除小鼠的原代神經(jīng)元中，MD2正常表達；在興奮毒性損傷后，MD2依然顯著上調(diào)；而給予以MD2為治療靶點的Tat-CIRP進行干預(yù)，細胞死亡被

19、逆轉(zhuǎn)。在體實驗結(jié)果也顯示，與野生型小鼠相比，缺血再灌注損傷后，TLR4基因敲除小鼠的損傷程度減輕；而如果缺血后給予Tat-CIRP治療，其損傷程度進一步減輕。
　　結(jié)論：MD2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，可以不依賴于傳統(tǒng)的TLR4信號通路，在神經(jīng)元中介導(dǎo)細胞死亡。以MD2為干預(yù)靶點而合成的短肽，Tat-CIRP能夠顯著減輕興奮毒性損傷，改善缺血及出血性腦卒中的預(yù)后。因此，Tat-CIRP的應(yīng)用可以不依賴于CT及MRI檢查結(jié)果，可以在癥狀出現(xiàn)