影響PD鼠腦病理改變的基因篩選及表達(dá)的研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是中老年常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)退行性疾病，多巴胺(Dopamine，DA)能神經(jīng)細(xì)胞移植是治療PD的有效手段之一，恰當(dāng)并且充足的細(xì)胞供體源則是成功施行腦細(xì)胞移植治療PD的關(guān)鍵。神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells，NSCs)作為具有多重分化潛能和自我更新能力的高度未分化細(xì)胞，被視為腦細(xì)胞移植治療腦疾病的理想供體細(xì)胞。但NSCs的分化非常復(fù)雜，正常情況下，其分化為DA神經(jīng)元

2、的比例不超過0.01％。因此，在細(xì)胞移植前必須先誘導(dǎo)NSCs定向分化為DA神經(jīng)元，才能有效糾正PD的癥狀。 研究發(fā)現(xiàn)，NSCs的分化受到分化微環(huán)境中多種因素的影響。目前，已被證實(shí)具有促使NSCs向DA神經(jīng)元定向分化作用的因子包括：IL-α，IL-11，白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor，LIF)以及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glialcell-derivednetlrotrophicfactor，G

3、DNF)。Storch等發(fā)現(xiàn)在上述細(xì)胞因子混合液的基礎(chǔ)上加入紋狀體細(xì)胞分泌液，人類中腦來源NSCs分化為TH陽性多巴胺能神經(jīng)元的比例驟升了近6倍，分化細(xì)胞具有成熟DA神經(jīng)元形態(tài)。Hitoo等發(fā)現(xiàn)，將NSCs移植到以6-羥基多巴胺(6-OHDA)毀損制作的PD模型鼠紋狀體內(nèi)后，DA神經(jīng)元會(huì)更多，細(xì)胞更大，突起更長，他們用抗體阻斷技術(shù)證實(shí)，在毀損側(cè)紋狀體內(nèi)GDNF和bFGF的分泌增加，有促DA神經(jīng)元分化作用。這些研究提示，在紋狀體內(nèi)存在著誘

4、導(dǎo)NSCs向DA神經(jīng)元定向分化的因子，而以6-OHDA毀損黑質(zhì)-紋狀體通路后，紋狀體內(nèi)這些因子的含量顯著增強(qiáng)，或者分泌了新的因子。 因此本課題擬通過立體定向方法紋狀體內(nèi)注射6-OHDA制備單側(cè)PD模型，利用抑制性消減雜交(Suppressionsubtractivehybridization，SSH)，比較健側(cè)與毀損側(cè)紋狀體細(xì)胞之間mRNA的表達(dá)差異，分析在6-OHDA毀損后，紋狀體分泌因子的變化，構(gòu)建差異cDNA文庫，選取相關(guān)

5、基因，研究其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的影響。 在第一部分實(shí)驗(yàn)中采用立體定向方法紋狀體內(nèi)注射6-OHDA制備PD模型，通過行為學(xué)以及高效液相色譜電化學(xué)方法進(jìn)行檢測，以期建立PD實(shí)驗(yàn)研究所需的穩(wěn)定、可靠的理想模型，為在PD中進(jìn)一步觀察影響黑質(zhì)紋狀體病理變化的基因篩選及其表達(dá)的研究提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.立體定向紋狀體內(nèi)注射6-OHDA制備的PD模型，其行為學(xué)改變呈漸進(jìn)性過程。于術(shù)后兩周大鼠出現(xiàn)緩慢旋轉(zhuǎn)，直至術(shù)后第4周

6、旋轉(zhuǎn)行為達(dá)到7轉(zhuǎn)/分以上，并保持基本穩(wěn)定至第16周。 2.高效液相色譜-電化學(xué)法(HPLC-EC)組織勻漿檢測非注射側(cè)和注射側(cè)黑質(zhì)中DA含量由0.79nmol/l下降為0.26nmol/l，大約下降了67％，有顯著性差異。其代謝產(chǎn)物3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)含量下降62.5％。 3.TH免疫組織化學(xué)染色可見TH陽性神經(jīng)元分布于黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋部，其形態(tài)為大多角形或錐形細(xì)胞，胞漿棕染。半定量分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)后顯示：注射生

7、理鹽水組大鼠黑質(zhì)部位左、右兩側(cè)TH免疫陽性產(chǎn)物數(shù)量無顯著性差異；術(shù)后4周，6-OHDA注射組大鼠黑質(zhì)部位左、右兩側(cè)TH免疫陽性產(chǎn)物數(shù)量存在顯著性差異(P＜0.05)；6、8、12、16周后，注射組大鼠黑質(zhì)部位左、右兩側(cè)TH免疫陽性產(chǎn)物數(shù)量均存在極顯著性差異(P＜0.01)。 在第二部分實(shí)驗(yàn)中，采用SSH技術(shù)比較PD模型健側(cè)與患側(cè)紋狀體組織細(xì)胞間mRNA的表達(dá)差異，結(jié)合分子克隆和反向Northern雜交技術(shù)，構(gòu)建了差異表達(dá)cDNA

8、文庫。初步篩選和分析了6個(gè)上調(diào)表達(dá)克隆和6個(gè)下調(diào)表達(dá)克隆。功能上較明確的有：高親和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(slcla1)；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TrfR)；REST/NRSF相互作用限制結(jié)構(gòu)域蛋白(RILP)；重組胰島素樣生長因子(Mtpn)；不均一核糖核酸核蛋白A/B(Hnrpab)；巖藻糖-1-磷酸鳥苷?；D(zhuǎn)移酶(Fpgt)；前列腺雄激素抑制信使1(Cipar1)；纖連蛋白5(fibulin5)；D123基因產(chǎn)物；白介素22α2受體(I122Rα2)

9、。 在第三部分實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，構(gòu)建pEGFP-Slclal真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，提取細(xì)胞液，觀察細(xì)胞提取液對(duì)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-slclal。 2.成功轉(zhuǎn)染pEGFP-Slclal重組子進(jìn)入培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可見神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有較多綠色熒光蛋白表達(dá)；并且轉(zhuǎn)染pEGFP-Slclal重組子的

10、培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中S1clalmRNA呈高表達(dá)。 3.轉(zhuǎn)染pEGFP-Siclal重組子的培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞提取液可以提高TH陽性細(xì)胞比例，但是與自然狀態(tài)分化差異不顯著(P＞0.05)；細(xì)胞提取液+細(xì)胞因子混合液能明顯提高TH陽性細(xì)胞含量，與自然狀態(tài)分化相比具有顯著差異(P＜0.01)。 總之，在6-OHDA制備單側(cè)PD大鼠模型中，其患側(cè)與健側(cè)紋狀體細(xì)胞內(nèi)確實(shí)存在多種mRNA的差異表達(dá)。對(duì)構(gòu)建的差異表達(dá)cDNA文庫進(jìn)行的初