Homer和Shank基因表達(dá)改變?cè)谀X損傷和腦膠質(zhì)瘤病理過程中的意義.pdf

1、本研究主要分為兩部分。
　　第一部分：腦損傷后腦內(nèi)Homer與Shank基因的改變及意義
　　腦損傷主要包括創(chuàng)傷性腦損傷（Traumaticbraininjury，TBI）和缺血性腦損傷，殘、死率高[1-2]。腦損傷的發(fā)生、發(fā)展可能與谷氨酸神經(jīng)毒性、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)和血-腦脊液屏障破壞等因素有關(guān)，但其確切的分子病理機(jī)制尚不清楚，這是治療效果差的根本原因[3-4]。我們?cè)隗w外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型上，發(fā)現(xiàn)一種

2、即早基因(immediatelyearlygene，IEG)Homer及其下游分子Shank，能調(diào)控多種細(xì)胞分子，通過多種信號(hào)通路廣泛參與腦損傷發(fā)生、發(fā)展的核心過程[5]。本課題擬在以往工作基礎(chǔ)上，通過在體動(dòng)物的多種腦損傷模型，如側(cè)向瞬時(shí)旋轉(zhuǎn)致彌漫性軸索損傷（diffuseaxonalinjury，DAI）模型、Marmarou加速致彌漫性腦損傷（diffusebraininjury，DBI）模型及缺血性腦損傷模型，檢測(cè)Homer和Sh

3、ank在損傷腦組織中的表達(dá)及其意義，為探索腦損傷的發(fā)生機(jī)制及其相關(guān)治療提供理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)一、大鼠DAI后，腦內(nèi)Homer的表達(dá)改變及意義
　　目的：研究大鼠DAI后，腦內(nèi)Homer蛋白各亞型表達(dá)變化規(guī)律及意義。方法：選擇成年雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組與DAI后30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h及72h共10組，每組12只；應(yīng)用側(cè)向瞬時(shí)旋轉(zhuǎn)致DAI，取大鼠腦干區(qū)主要核團(tuán)、皮層和海

4、馬組織進(jìn)行檢測(cè)；采用免疫組化染色法行免疫組化評(píng)分檢測(cè)；Westernblot法行蛋白測(cè)定；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法行mRNA測(cè)定。結(jié)果：①免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和假手術(shù)組中神經(jīng)元Homer1a染色呈陰性，DAI組神經(jīng)元Homer1a染色呈陽性，陽性染色呈顆粒狀分布于胞漿、胞膜及突起結(jié)構(gòu)；傷后30minHomer1a蛋白出現(xiàn)表達(dá)，一直持續(xù)至傷后72h，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組Homer1a蛋白免疫評(píng)分相比，DAI后24h出現(xiàn)表

5、達(dá)高峰（P<0.01）；Homer1b/c在各組神經(jīng)元中均有一定程度表達(dá)，但表達(dá)量無明顯變化；②與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比較，在DAI后30min，Homer1a蛋白及其mRNA開始表達(dá)，1h～72h表達(dá)量明顯增加，在24h達(dá)到高峰（P<0.01），但72h仍維持較高水平（P<0.05）；③Homer1b/c在正常對(duì)照組、假手術(shù)組和DAI組神經(jīng)元中均有一定程度表達(dá)，無論蛋白還是mRNA表達(dá)水平，其表達(dá)量均無明顯變化(P>0.05)；DA

6、I④后，在30min～24h，腦干Homer1a蛋白及其mRNA表達(dá)量均大于皮層和海馬（P<0.05），但在48～72h無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；其在皮層和海馬之間無差異（P>0.05）；Homer1b/c蛋白及其mRNA表達(dá)量在上述三個(gè)部位也無差異（P>0.05）。結(jié)論：DAI刺激可誘導(dǎo)Homer1a基因快速表達(dá)，可能與DAI后，大量谷氨酸釋放，細(xì)胞興奮性增加有關(guān)，而Homer1b/c表達(dá)不受神經(jīng)元興奮性活動(dòng)調(diào)節(jié)。結(jié)合以往文獻(xiàn)認(rèn)為

7、，DAI后，動(dòng)態(tài)表達(dá)的Homer1a與持續(xù)表達(dá)的Homer1b/c共同調(diào)節(jié)mGluR1a的結(jié)構(gòu)和功能，其機(jī)制可能是Homer1a與Homer1b/c競爭結(jié)合mGluR1a，減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，調(diào)節(jié)mGluR1a在突觸部位的分布及受體信號(hào)傳遞效率，防止mGluR1a過度興奮。神經(jīng)元興奮性增高時(shí)，Homer1a表達(dá)增加，這是一種自然的、選擇性地調(diào)節(jié)mGluR1a與Homer1b/c結(jié)合的負(fù)反饋機(jī)制。而腦組織不同部位Homer1a表達(dá)量存

8、在差異可能與側(cè)向旋轉(zhuǎn)DAI致傷模型造成中線部分受損最嚴(yán)重有關(guān)，提示根據(jù)Homer1a表達(dá)量多少可判斷腦損傷嚴(yán)重程度。
　　實(shí)驗(yàn)二、大鼠DBI后，腦內(nèi)Homer的表達(dá)改變及意義
　　目的：研究大鼠DBI后，腦內(nèi)Homer蛋白各亞型表達(dá)變化規(guī)律及意義。方法：選擇成年雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組DBI后30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h及72h共10組，每組12只；采用Marmarou加速致

9、DBI模型，其它檢測(cè)內(nèi)容和方法同實(shí)驗(yàn)一。結(jié)果：①免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和假手術(shù)組中神經(jīng)元Homer1a染色呈陰性，DBI組神經(jīng)元Homer1a染色呈陽性，陽性染色呈顆粒狀分布于胞漿、胞膜及突起結(jié)構(gòu)；傷后30minHomer1a蛋白開始表達(dá)，一直持續(xù)至傷后72h，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組Homer1a蛋白免疫評(píng)分相比，DBI后24h出現(xiàn)表達(dá)高峰（P<0.01），同時(shí)，Homer1a在損傷膠質(zhì)細(xì)胞中也表達(dá)；Homer1b/c在各組

10、神經(jīng)元中均有一定程度表達(dá)，但表達(dá)量無明顯變化；②與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比，DBI后3h和24h，Homer1a蛋白及其mRNA表達(dá)量出現(xiàn)2個(gè)峰值（P<0.01），72h時(shí)仍維持較高水平（P<0.05）；③Homer1b/c結(jié)果同實(shí)驗(yàn)一結(jié)果；④DBI后30min～24h，Homer1a蛋白及其mRNA表達(dá)量在皮層和海馬均大于腦干的相應(yīng)值（P<0.05），而在48～72h兩者無差異（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)中，Homer1a蛋白及其mRNA表

11、達(dá)量在皮層和海馬之間無差異改變（P>0.05），而且，Homer1b/c蛋白及其mRNA表達(dá)量在腦干、皮層和海馬之間也無差異改變（P>0.05）。結(jié)論：DBI后Homer1a表達(dá)有兩個(gè)高峰，第一個(gè)高峰的出現(xiàn)可能與早基因蛋白Homer1a競爭性與Homer1b/c結(jié)合代謝性谷氨酸受體，降低其在突觸部位的聚集量，減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)；第二個(gè)高峰的出現(xiàn)可能與Homer1a還可能參與促進(jìn)受損神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞病理性凋亡有關(guān)，這種Homer1

12、a蛋白上調(diào)可能對(duì)受損腦組織有保護(hù)作用。另外，與實(shí)驗(yàn)一DAI后的結(jié)果不同，Homer1a表達(dá)量在海馬和皮層明顯增高，這可能與模型不同、海馬和皮層受損更嚴(yán)重、發(fā)生機(jī)制不同有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)三、大鼠缺血再灌注腦損傷后，腦內(nèi)Homer的表達(dá)改變及意義
　　目的：研究大鼠缺血再灌注腦損傷后，腦內(nèi)Homer蛋白各亞型表達(dá)變化規(guī)律及意義。方法：選擇成年雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組與缺血再灌注腦損傷后30min、1h、3

13、h、6h、12h、24h、48h及72h共10組，每組12只；采用大腦中動(dòng)脈阻塞致缺血再灌注損傷模型（MCAO），其它檢測(cè)內(nèi)容和方法同實(shí)驗(yàn)一。結(jié)果：①免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和假手術(shù)組中神經(jīng)元Homer1a染色呈陰性，損傷組神經(jīng)元Homer1a染色呈陽性，陽性染色呈顆粒狀分布于胞漿、胞膜及突起結(jié)構(gòu)；缺血再灌注損傷后30minHomer1a蛋白開始表達(dá)，一直持續(xù)至傷后72h，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組Homer1a蛋白免疫評(píng)分相比，

14、損傷后24h出現(xiàn)表達(dá)高峰（P<0.01），同時(shí)，Homer1a在損傷膠質(zhì)細(xì)胞中也表達(dá)；Homer1b/c在各組神經(jīng)元中均有一定程度表達(dá)，但表達(dá)量無明顯變化；②與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比，缺血再灌注腦損傷后，Homer1a蛋白及其mRNA表達(dá)量出現(xiàn)30min（P<0.01）、3h（P<0.01）和24h（P<0.01）3個(gè)高峰，72h時(shí)仍維持較高水平（P<0.05）；③Homer1b/c結(jié)果同實(shí)驗(yàn)一結(jié)果。結(jié)論：首先，缺血再灌注損傷后Hom

15、er1a表達(dá)有三個(gè)高峰，傷后30min出現(xiàn)的第一個(gè)高峰，可能與缺血損傷和再灌注損傷“疊加”，在損傷早期共同刺激及早基因Homer1a大量表達(dá)，與Homer1b/c競爭結(jié)合mGluRs，降低其在突觸部位的聚集量，減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)，DBI后無此表達(dá)高峰。其余兩個(gè)表達(dá)高峰則與Homer1a調(diào)節(jié)mGluRs分布，及促進(jìn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞病理性凋亡有關(guān)；其次，缺血再灌注腦損傷后Homer1a表達(dá)時(shí)空變化規(guī)律與上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，可能與發(fā)

16、生機(jī)制不同，缺血性腦損傷病理生理過程牽涉更多、更復(fù)雜信號(hào)通路有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)四、大鼠腦損傷后，腦內(nèi)Shank各亞型的表達(dá)改變及意義
　　Shank是一種多結(jié)構(gòu)域的骨架蛋白，可介導(dǎo)多種蛋白連接而成功能復(fù)合體，包括3個(gè)亞型，Shank1，Shank2和Shank3，在神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛分布，對(duì)于維持神經(jīng)元突觸的形態(tài)和功能有重要作用[6-7]。文獻(xiàn)報(bào)道，Shank蛋白通過調(diào)控Homer蛋白與mGluRs的錨定與信號(hào)傳導(dǎo)過程，參與了突觸

17、可塑性、學(xué)習(xí)和記憶等的病理生理機(jī)制。但是腦損傷后不同亞型Shank蛋白的表達(dá)時(shí)空變化規(guī)律，以及與腦損傷的關(guān)系等都未見報(bào)道。
　　目的：本課題擬在以往工作基礎(chǔ)上，通過上述3種在體動(dòng)物腦損傷模型，初步檢測(cè)腦損傷后不同亞型Shank蛋白的表達(dá)時(shí)空變化規(guī)律以及與腦損傷的關(guān)系，力求尋找出關(guān)鍵性Shank分子，為探索腦損傷的發(fā)病機(jī)制及其相關(guān)治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：取上述3種模型致?lián)p傷后的大鼠皮層組織進(jìn)行檢測(cè)。采用免疫組化染色法和Wester

18、nblot法行蛋白定位定量測(cè)定，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法行mRNA測(cè)定。結(jié)果：①免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，在3種模型中，腦損傷前后，Shank的3個(gè)亞型-Shank1、Shank2和Shank3都陽性表達(dá)，它們的陽性染色都呈顆粒狀分布于胞漿、胞膜及突起結(jié)構(gòu)。DAI②后，Shank的蛋白定量和mRNA定量檢測(cè)結(jié)果一致。Shank1，在所有組別都高表達(dá)，無變化趨勢(shì)，損傷前后表達(dá)量一致（P>0.05）；Shank2，正常組和假手術(shù)組都有表達(dá)，

19、DAI后30min其表達(dá)量開始增加，6h達(dá)到高峰（P<0.01），隨后下降，72h又出現(xiàn)表達(dá)高峰（P<0.01）；Shank3，正常組和假手術(shù)組都有表達(dá)，DAI后，30min到6h一直高表達(dá)（P<0.01），然后開始下降，至72h仍維持較高水平（P<0.05）。③DBI后，Shank的蛋白和mRNA定量檢測(cè)結(jié)果一致。Shank2，正常組和假手術(shù)組都有表達(dá)，DBI后30min其表達(dá)量開始增加，在3h到6h期間達(dá)到高峰（P<0.01），而D

20、BI前后Shank1和Shank3亞型表達(dá)變化結(jié)果，和DAI前后此兩個(gè)亞型結(jié)果基本一致。④缺血再灌注損傷后，Shank的蛋白和mRNA定量檢測(cè)結(jié)果一致。Shank1，正常組和假手術(shù)組都有表達(dá)，損傷后30min其表達(dá)量開始增加，出現(xiàn)2個(gè)高峰，3h（P<0.01）和12h（P<0.01），隨后下降，至72h仍維持較高水平（P<0.05）；Shank2，在所有組別都高表達(dá)，無變化趨勢(shì)，損傷前后表達(dá)量一致（P>0.05）；Shank3，正常組和