乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系靶向肽BRBP1受體的尋找與鑒定.pdf

1、乳腺癌(Breast cancer)是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年提高，已成為嚴(yán)重威脅女性健康的重大疾病之一。腦轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者致死、致殘的重要原因，大約10-30％的散發(fā)性患者會(huì)發(fā)生乳腺癌腦轉(zhuǎn)移(BCBM)，用標(biāo)準(zhǔn)療法（standard treatments），包括全腦放射治療(wholebrain radiotherapy，WBRT)、立體定向放射治療（stereotactic radiosurgery，SRS）和手術(shù)(Sur

2、gery)，平均中位生存期也只有1年。為此，研究乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，闡明腦轉(zhuǎn)移過程的相關(guān)靶標(biāo)至關(guān)重要。
　　我們實(shí)驗(yàn)室前期利用噬菌體展示肽庫(kù)篩選技術(shù)(Phage display technology)對(duì)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系231-BR進(jìn)行全細(xì)胞消減篩選，成功獲得了與231-BR細(xì)胞系特異性結(jié)合的多肽BRBP1（專利號(hào):ZL201210538671.4），體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究均已證實(shí)該肽與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系呈現(xiàn)出高親和力結(jié)合，并且基于B

3、RBP1肽構(gòu)建的近紅外熒光成像分子探針可用于腦轉(zhuǎn)移性乳腺癌荷瘤鼠活體近紅外熒光成像，構(gòu)建的BRBP1-TAT-KLA復(fù)合肽可顯著抑制乳腺癌腦轉(zhuǎn)移灶的生成及生長(zhǎng)。臨床乳腺癌組織水平的初步研究也顯示其與乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移手術(shù)切除標(biāo)本特異性結(jié)合。因此，尋找與BRBP1肽特異結(jié)合的受體對(duì)深度認(rèn)識(shí)BRBP1肽的功能、拓寬BRBP1肽的應(yīng)用價(jià)值、探索乳腺癌腦轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。本研究課題主要內(nèi)容包括以下:
　　1.乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系靶

4、向肽體的表達(dá)與特異性鑒定
　　利用基因重組技術(shù)構(gòu)建pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1真核表達(dá)載體，表達(dá)BRBP1-Fc肽體，通過Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白表達(dá)正確，ELISA、流式細(xì)胞術(shù)以及競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫熒光等實(shí)驗(yàn)證實(shí)BRBP1-Fc肽體保留BRBP1肽與231-BR細(xì)胞結(jié)合特性，為尋找BRBP1肽的受體以及進(jìn)一步研究BRBP1的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　2.免疫（共）沉淀方法對(duì)BRBP1肽特異性受體

5、的尋找與鑒定
　　目前尋找受體的方法有多種，但是并無(wú)普遍適用且保證成功的方法可遵循。本研究采用免疫（共）沉淀的方法尋找BRBP1肽的受體。即利用真核表達(dá)的BRBP1-Fc肽體和Protein G磁珠相互作用，合成BRBP1-BIOTIN生物素肽和鏈霉親和素磁珠相互作用，通過免疫（共）沉淀的方法捕獲與之相互作用的蛋白。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?duì)照，借助銀染方法尋找差異性條帶，通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析具體蛋白分子。差異表達(dá)蛋白共有24個(gè)，我們首先分

6、析兩次質(zhì)譜結(jié)果共有的Annexin A2分子，通過細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在231-BR、MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞表面的表達(dá)情況符合期望受體分布，繼而通過siRNA、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究Annexin A2是否和BRBP1肽相互作用。但是目前還沒有明確二者的具體關(guān)系，仍有待后續(xù)進(jìn)一步探究。此外，我們通過生物信息學(xué)軟件分析得到3個(gè)候選受體分子(SND1，S100A8，AP2B1)，需要后期實(shí)驗(yàn)證明。
　　3.基于數(shù)據(jù)庫(kù)生物信

7、息學(xué)分析篩選BRBP1肽的受體
　　Matthew D.Dun等研究者就乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞231-BR和乳腺癌親代細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞在protein、mRNA、miRNA層面的差異做了綜合、系統(tǒng)、全面、前沿的分析。Riesa M.B.等橫向進(jìn)行了乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞(231-BR)、肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞(LMD-231)、骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞(BMD-231)、腎上腺轉(zhuǎn)移細(xì)胞(ADMD-231)以及乳腺癌親代細(xì)胞(MD-231P)的基因芯片技術(shù)。

8、通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，我們共得到5個(gè)在231-BR細(xì)胞上調(diào)的膜分子，聯(lián)合MCF-7細(xì)胞為對(duì)照，通過定量PCR技術(shù)初步篩選，發(fā)現(xiàn)相較于MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞，Moesin分子在231-BR細(xì)胞明顯高表達(dá)。隨后我們又通過Western blotting、細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Moesin分子表達(dá)情況符合期望受體分布。繼而我們通過siRNA干擾實(shí)驗(yàn)研究Moesin分子和BRBP1肽相互作用情況。目前，我們已通過干擾實(shí)驗(yàn)初