大鼠心臟微血栓的多模態(tài)靶向分子成像研究.pdf

1、動脈血栓形成是在急性缺血性心腦血管疾病的主要發(fā)病機制，最近研究表明微血栓形成在心血管疾病中同樣扮演著重要角色。但目前臨床缺乏微血栓的檢測手段，本研究評估了基于納米顆粒的冠脈微血栓多模態(tài)靶向分子顯像的可行性。
　　在評價SPIO致凝性基礎(chǔ)上，利用SPIO作為載體連接CREKA分子短肽及IR783熒光探針，構(gòu)建SPIO-CREKA納米顆粒，并在體外試驗驗證了SPIO-CREKA對纖維蛋白的靶向結(jié)合能力。體內(nèi)試驗中，利用心臟缺血再灌注方

2、法成功構(gòu)建大鼠心臟微血栓模型，靜脈注射SPIO-CREKA后，成功實現(xiàn)心臟微血栓的多模態(tài)分子顯像（MRI及活體光學(xué)顯像）。
　　第一部分:SPIO體外致栓性的研究
　　目的:通過探討體外不同濃度50 nmSPIO的致栓性，評價其作為藥物載體的安全性。
　　方法:以PBS為對照組，將0.02 mg/ml、0.1 mg/ml、0.5 mg/ml濃度的SPIO與血漿或全血在體外共孵育，檢測血小板聚集率、凝血功能、血凝塊質(zhì)量及

3、血栓彈力圖。
　　結(jié)果:(1) PBS組、0.02 mg/ml SPIO組、0.1 mg/ml SPIO組及0.5 mg/ml SPIO組血小板聚集率分別為67.3±5.9％、68.3±4.5％、66.2±5.5％及69.5±5.9％(P＞0.05);(2)4組的APTT值分別為28.1±2.7 S、28.5±2.4 S、28.2±2.5 S及29.1±3.6S(P＞0.05)，PT值和TT值各組間也無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

4、(3)血栓彈力圖各參數(shù)(反應(yīng)凝血功能的R時間、反應(yīng)纖維蛋白原功能的K時間及α角、反應(yīng)血小板功能的MA值、凝血綜合指數(shù)CI)，各組間比較差異均無顯著性(P＞0.05)。(4)4組的血凝塊質(zhì)量分別為759.6±38.7 mg、758.8±47.2 mg、769.8±39.2mg和766.8±40.8mg，組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:50 nmSPIO在一定濃度范圍內(nèi)(0.02mg/ml-0.5mg/ml)對血小板

5、聚集、凝血功能、血凝塊質(zhì)量及血栓彈力圖均無明顯影響，表明其無致栓性，血液相容性較好，可較為安全的應(yīng)用于血栓性疾病的研究。
　　第二部分 SPIO-CREKA的制備及表征
　　目的:構(gòu)建可靶向纖維蛋白的多功能熒光磁性納米體系，用于微血栓的多模態(tài)檢測，并檢測該磁性納米體系的表征及體外致栓性。
　　方法:將熒光探針與SPIO連接后，PEG修飾SPIO，并通過Maleimide-PEG與CREKA共價結(jié)合，得到IR783-R-

6、SPIO-CREKA。通過動態(tài)光散射法檢測SPIO-CREKA粒徑、粒徑分布寬度以及表面膜電位，透射電鏡觀察粒子形態(tài)。分別使用紫外分光光度法、熒光分光光度法、紫外分光光度法及高效液相色譜法檢測IR783、rhodamine、PEG及CREKA連接效率。通過不同濃度SPIO-CREKA與血漿共孵育，檢測其對凝血功能及血小板聚集率的影響，評估SPIO-CREKA致栓性。
　　結(jié)果:SPIO-CREKA粒徑分布集中(PDI＜0.25)，

7、粒徑集中分布在1OOnm左右，電位在-2.2mv左右。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)SPIO-CREKA中間為一直徑為10-20nm密度較大的磁核，外面被一層葡聚糖包裹。每個SPIO磁珠表面連接有300IR分子、1500個Rhodamine分子、6000個PEG分子及2000 CREKA分子，可有效地利用熒光顯微鏡、活體成像等技術(shù)檢測SPIO在大鼠體內(nèi)的分布。不同濃度SPIO-CREKA對APTT、PT、TT及血小板聚集率無明顯影響(各組間比較P＞0

8、.05)，其致凝性較低，可安全的應(yīng)用于體內(nèi)微血栓的靶向顯像。
　　結(jié)論:本研究利用多功能SPIO為載體，攜載近紅外熒光探針及靶向纖維蛋白分子CREKA，構(gòu)建了可對血栓性疾病進行多模態(tài)無創(chuàng)顯像（MRI及活體光學(xué)顯像）納米體系，該納米體系表面熒光探針及CREKA密度高，致栓性低，可安全的應(yīng)用于微血栓多模態(tài)成像的研究。
　　第三部分大鼠心肌缺血再灌注后微血栓的表達及其機制的初步研究目的:檢測大鼠心肌缺血再灌注24h后是否有微血栓的

9、形成及其主要成分，并對微血栓產(chǎn)生機制做初步探討。
　　方法:制作大鼠心肌缺血再灌注模型，通過即刻心電圖描記及心超、心臟組織病理學(xué)檢測評價模型成功性，通過對纖維蛋白免疫熒光染色觀察微血栓的形成及分布，通過透射電鏡檢測確定微血栓主要成分，通過對缺血局部心肌TF及PAI-1免疫組化染色，初步探討微血栓形成的可能機制。
　　結(jié)果:大鼠心肌缺血再灌注24h后，I/R組大鼠左室前壁左前降支供血范圍內(nèi)可見纖維蛋白沉積，而左室后壁、右室及s

10、ham組大鼠心臟內(nèi)均未見纖維蛋白表達。激光共聚焦顯微鏡觀察可見纖維蛋白網(wǎng)羅血細胞在小血管內(nèi)形成微血栓。透射電鏡觀察可見微血栓的主要成分為纖維蛋白、血小板及紅細胞。I/R組大鼠缺血心肌局部較sham組大鼠反應(yīng)TF及PAI-1升高。
　　結(jié)論:大鼠心肌缺血再灌注24h后缺血局部有微血栓形成，其成分包括纖維蛋白、血小板及紅細胞。心臟缺血局部TF及PAI-1表達升高，提示心肌缺血局部凝血系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)失平衡可能是導(dǎo)致微血栓形成的原因之一。

11、
　　第四部分:大鼠心肌缺血再灌后微血栓的多模態(tài)顯像
　　目的:檢測IR783標記的SPIO-CREKA對纖維蛋白的靶向能力，對大鼠心臟微血栓進行多模態(tài)分子顯像。
　　方法:通過SPIO-CREKA與纖維蛋白栓子共孵育，分別通過熒光顯微鏡、光學(xué)活體成像系統(tǒng)及MRI成像系統(tǒng)體外驗證SPIO-CREKA與纖維蛋白的靶向結(jié)合能力及對血栓的成像能力;制作大鼠心肌缺血再灌注模型，尾靜脈注射PBS、SPIO-PEG及SPIO-CR

12、EKA，并使其循環(huán)4h，通過心臟組織學(xué)檢查及電鏡觀察驗證SPIO-CREKA體內(nèi)與微血栓靶向結(jié)合能力，通過MRI及光學(xué)成像系統(tǒng)檢測SPIO-CREKA對微血栓的靶向多模態(tài)分子顯像能力，并通過器官離體成像研究SPIO-CREKA在各組織的分布。
　　結(jié)果:(1)體外試驗中，熒光顯微鏡觀察SPIO-CREKA組在纖維蛋白栓子表面可見紅色熒光，而PBS組及SPIO-PEG組均無明顯熒光;在活體成像下觀察血栓凝塊可見SPIO-CREKA組

13、熒光強度為SPIO-PEG組的7.5倍，P＜0.001;MRI成像中，SPIO-CREKA組在MRI顯示為低信號，信號值為（66.4±13.7），而SPIO-PGE組信號改變不明顯，為（201.8±11.0），PBS組信號值為（210.9±17.2），SPIO-CREKA組與SPIO-PEG組及PBS組比較，P＜0.001。(2)在大鼠心臟缺血再灌注24h后，心臟局部微血栓形成模型中，大鼠接受尾靜脈注射相應(yīng)納米材料4h后進行磁共振顯像。

14、SPIO-CREKA組大鼠心臟左室前壁損傷區(qū)在T2加權(quán)像是顯示為低信號，LVAM相對信號強度為(0.65±0.07)，SPIO-PEG組為（0.95±0.08），PBS組為（0.99±0.11），SPIO-CREKA組與其相比，P＜0.01，sham組接受SPIO-CREKA其LVAM相對信號強度為（0.92±0.06）。心臟離體光學(xué)成像示:SPIO-CREKA組心臟局部熒光強度是SPIO-PEG組的1.95倍（1.88±0.5×107

15、vs.0.96±0.09×107，P＜0.001），PBS組熒光強度為0.99±0.1×107，sham+SPIO-CREKA組熒光強度為0.94±0.1×107。SPIO-CREKA及SPIO-PEG主要分布在肝臟及腎臟內(nèi)，連接CREKA并未改變SPIO組織分布。心臟組織學(xué)檢測:大鼠I/R后組織切片共聚焦發(fā)現(xiàn)，SPIO-CREKA組SPIO-CREKA結(jié)合在微血栓表面，而PBS組及SPIO-PEG組未見明顯紅色熒光。電鏡觀察提示血管壁