血栓靶向脂質(zhì)微泡的制備及其在動脈血栓檢測中的應用.pdf

1、研究背景：
　　 隨著社會的發(fā)展和人口老齡化的進程，血栓栓塞性疾病的發(fā)病率逐年增加。據(jù)統(tǒng)計，全球每年有1500萬人死于血栓栓塞性疾病，已經(jīng)成為全球總死亡率的第一位。我國每年的發(fā)病人數(shù)有1000萬，病死人數(shù)有100萬，致殘率也很高?，F(xiàn)在人類正面臨著血栓栓塞性疾病的巨大挑戰(zhàn)。
　　 因而臨床上早期準確地檢出并治療血栓對于降低死亡率及并發(fā)癥發(fā)生率非常重要。數(shù)字減影血管造影（DSA）一直是診斷血管病變的金標準，但DSA是有創(chuàng)性

2、的檢查，有2%—4%的并發(fā)癥，而且價格昂貴。磁共振血管成像（MRA）、CT血管成像（CTA）雖能較好的顯示血管及其出血，但費用高，而且在顯示較小的血栓方面有較大的局限。超聲是一種被廣泛應用于臨床的影像檢測手段,對血栓性疾病的早期診斷與隨訪觀察具有重要的意義。但由于新鮮血栓的回聲與血液回聲基本相似，超聲對新鮮血栓的檢出率受到限制。
　　 1968年美國的Gramiak首先提出超聲對比顯影的概念，他們在心內(nèi)注射吲哚青藍染料(indo

3、cyanine green dye)后超聲心動圖上可見云霧狀聲影。他們將產(chǎn)生的對比效果歸因為注射吲哚青藍染料溶液產(chǎn)生的氣泡。從那以后，吲哚青藍染料成為標準的超聲造影劑。到目前已經(jīng)發(fā)展到了第三代。第一代微泡的充填氣體為空氣，并實現(xiàn)了外周靜脈注射，是微泡超聲造影劑發(fā)展的一個里程碑，但它在血中維持時間短，不能滿足臨床的要求；第二代微泡充填氣體為氟碳氣體，穩(wěn)定性好，是臨床應用的主要產(chǎn)品；第三代微泡是一種靶向微泡，可以實現(xiàn)組織的定位顯影，目前國內(nèi)

4、外尚處于實驗室研究階段。故靶向超聲造影劑已成為近年國內(nèi)外研究的熱點，有良好的研究前景和巨大的商業(yè)價值。因此我們的課題組就期待制備出一種親血栓性靶向超聲造影劑，以改善血栓的超聲顯影效果，從而提高超聲檢出新鮮血栓的準確性和敏感性。
　　 研究目的：
　　 研究制備血栓靶向性脂質(zhì)微泡超聲造影劑的方法，測定其生物學活性，通過目測及視頻分析法評價該靶向超聲造影劑增強兔頸總動脈新鮮血栓顯像的效果。
　　 研究方法：
　

5、　 一、普通脂質(zhì)氟碳微泡的制備及生物學活性的測定
　　 將二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、二棕櫚酰磷脂酰甘油（DPPG）、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、膽固醇（Cholesterol）按一定摩爾比例經(jīng)薄膜-水化法制備成脂質(zhì)微泡。用普通顯微鏡觀測微泡的穩(wěn)定性，用Zetasizer Nano ZS90測量微泡的粒徑及表面電位，采用血細胞計數(shù)儀檢測微泡的濃度。
　　 二、血栓靶向脂質(zhì)氟碳微泡的制備及生物學活性的測定

6、>　　 將熒光標記二棕櫚酰磷脂酰膽堿（NBD PC）、DPPG、生物素標記二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺（Biotinyl PE）、Cholesterol按一定摩爾比例經(jīng)薄膜-水化法制備成脂質(zhì)微泡。用普通顯微鏡及熒光顯微鏡觀測微泡的外觀和穩(wěn)定性，用Zetasizer Nano ZS90測微泡的粒徑及表面電位，采用血細胞計數(shù)儀檢測微泡的濃度。
　　 三、動物血栓模型的建立及穩(wěn)定性的評價
　　 本實驗采取化學損傷-FeCl3誘導的方

7、法來制備兔頸總動脈血栓模型，取九只家兔根據(jù)FeCl3浸潤時間隨機分成三組：20min（第1組）、40min（第2組）、60min（第3組）每組各三只，實驗完成后取血管段進行石蠟包埋、HE染色作病理檢測來評價血栓模型。
　　 四、不同的檢測方法對血栓模型的影像學評價
　　 血栓模型的建立：取家兔二十只，游離家兔右側(cè)頸總動脈約2cm，模型建立前用彩色多普勒血流顯像（Color Doppler Flow Imaging，CDF

8、I）來獲取正常血管的超聲圖像并儲存，然后采用70%的FeCl3溶液浸潤40min，誘發(fā)右側(cè)頸總動脈非梗阻性血栓形成。用CDFI來檢測模型建立后的血栓超聲圖像并儲存。注入造影劑的超聲造影：經(jīng)耳緣靜脈團注0.5ml/kg普通脂質(zhì)微泡，連續(xù)觀察10min；爆破殘留的微泡5min后再團注0.5ml/kg SonoVue，連續(xù)觀察10min；爆破殘留的微泡5min后再依次注入生物素化的兔抗人纖維蛋白原0.1ml（1:200稀釋）、30min后注入

9、0.1ml親和素（1:20稀釋）、30min后團注0.5ml/kg靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑，連續(xù)觀察10min；造影前后適時動態(tài)圖像儲存。血栓模型的MRI檢測：超聲檢查完成后將模型進行三維時間飛越法磁共振血管成像Three-Dimensional Time-Of-Flight Magnetic Resonance Angiography，3D TOF MRA）并儲存圖像。造影結(jié)果評價：分別讓五位不同的超聲科醫(yī)師對視頻圖像進行影像學的評價。

10、
　　 五、血栓靶向脂質(zhì)微泡的體內(nèi)外靶向結(jié)合實驗
　　 取家兔四只用同樣的方法建立頸總動脈非梗阻性血栓模型，隨機選取兩只家兔取下病變血管段置于2ml生理鹽水中依次加入生物素化的兔抗人纖維蛋白原0.1ml（1:200稀釋）、30min后加入0.1ml親和素（1:20稀釋）、30min后加入0.5ml/kg靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑，將一部分標本快速冷凍切片后作熒光檢測，將另一部分標本做透射電鏡檢測，觀察靶向脂質(zhì)微泡在血栓內(nèi)的分

11、布情況。另外兩只家兔經(jīng)耳緣靜脈依次注入生物素化的兔抗人纖維蛋白原0.1ml（1:200稀釋）、30min后注入0.1ml親和素（1:20稀釋）、30min后團注0.5ml/kg靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑，將一部分標本快速冷凍切片后作熒光檢測，將另一部分標本做透射電鏡檢測，觀察靶向脂質(zhì)微泡在血栓內(nèi)的分布情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 一、普通脂質(zhì)氟碳微泡的制備及生物學活性的測定
　　 普通脂質(zhì)氟碳微泡制備后外觀呈乳白色

12、，靜置后可見微泡浮于液面之上，平均粒徑為0.8-2.5μm，部分微泡的粒徑達到了納米級。微泡表面的Zeta電位（Zeta Potential）約為-11 mV，微泡濃度約為1.08×1010個/mL。室溫下放置一周左右微泡的粒徑及表面的Zeta電位無明顯的變化，但微泡的濃度有所降低，室溫下放置半個月左右顯微鏡下只可見微泡數(shù)量明顯減少，室溫下放置一個月左右顯微鏡下只可見散在的微泡。
　　 二、血栓靶向脂質(zhì)氟碳微泡的制備及生物學活性

13、的測定
　　 血栓靶向脂質(zhì)氟碳微泡的制備后外觀呈橘黃色，靜置后可見微泡浮于液面之上，平均粒徑為1.1-2.5μm，微泡表面的平均Zeta電位（Zeta Potential）約為-11 mV，微泡濃度為6.5×109個/mL。室溫下放置一周左右微泡的粒徑及表面的Zeta電位無明顯的變化，但微泡的濃度明顯降低，室溫下放置半個月左右顯微鏡下只可見散在的微泡存在，其穩(wěn)定性比普通的脂質(zhì)微泡相比略差。
　　 三、動物血栓模型的建立及

14、穩(wěn)定性的評價
　　 肉眼觀：第1組模型血管管腔內(nèi)未見明顯的血栓形成。第2組模型血管官腔可見非梗阻性血栓形成，血栓約占管腔1/4-1/3。第3組模型可見梗阻閉塞性血栓形成，血栓占據(jù)整個管腔。鏡下觀：第2、3組為混合型血栓，血栓結(jié)構(gòu)致密。
　　 四、不同的檢測方法對血栓模型的影像學評價
　　 實驗的二十只家兔建模型前CDFI顯示右側(cè)頸總動脈血流信號通暢，管腔完整。模型建立后CDFI圖像只有四只家兔血管中可見較為明顯的

15、充盈缺損及血流信號的不連續(xù)，其余的圖像顯示欠佳。普通脂質(zhì)微泡團注后3s在右側(cè)頸總動脈腔內(nèi)顯影，10s左右顯影達到峰值，可見血栓局部管腔內(nèi)明顯的充盈缺損，管壁欠光滑，管腔內(nèi)血流信號不連續(xù)，顯影持續(xù)60s左右，只有十只家兔均顯影尚可，其余圖像顯示欠佳。SonoVue團注后3s在右側(cè)頸總動脈腔內(nèi)顯影，20s左右顯影達到峰值，可見血栓局部管腔內(nèi)明顯的充盈缺損，管壁欠光滑，管腔內(nèi)血流信號不連續(xù)，顯影持續(xù)150s左右，二十只家兔均顯影良好。靶向脂質(zhì)

16、微泡團注后3s在右側(cè)頸總動脈腔內(nèi)顯影，25s左右顯影達到峰值，可見血栓局部管腔內(nèi)明顯的充盈缺損，管壁欠光滑，管腔內(nèi)血流信號不連續(xù)，顯影持續(xù)200s左右，二十只家兔均顯影良好。3D-TOF-MRA的圖像只有三只家兔右側(cè)頸總動脈血栓局部血流信號變窄，管壁欠光滑，其余的圖像顯示欠佳。
　　 五、血栓靶向脂質(zhì)微泡的體內(nèi)外尋靶實驗
　　 體內(nèi)外兩組實驗快速冰凍切片后熒光顯微鏡觀察均顯示管腔內(nèi)血栓局部有靶向脂質(zhì)微泡聚集帶，部分微泡聚

17、集在血栓內(nèi)部，不同的是體外實驗組靶向脂質(zhì)微泡聚集量較體內(nèi)實驗組較多，發(fā)出的熒光更明顯。體內(nèi)外兩組實驗電鏡圖片均顯示血栓內(nèi)有靶向脂質(zhì)微泡聚集，體外實驗組靶向脂質(zhì)微泡聚集量仍較體內(nèi)實驗組為多。
　　 研究結(jié)論：
　　 一、本實驗初步成功制備了血栓靶向脂質(zhì)微泡并成功的將其應用于血栓的靶向性檢測上，為國內(nèi)開發(fā)自主的靶向超聲造影劑奠定了良好的基礎，有良好的研究前景和巨大的商業(yè)價值。
　　 二、血栓靶向脂質(zhì)微泡在血栓的超聲檢