攜P-選擇素單抗靶向微泡結(jié)合對比超聲評價動脈早期血栓效果的研究.pdf

1、背景和目的:血栓性疾病包括動、靜脈血栓性疾病,是臨床常見的急危重癥,具有高發(fā)性、高致殘性和高致死性等特點,嚴(yán)重危害人類生命健康。目前血栓性疾病診斷主要依賴于臨床表現(xiàn)和多普勒超聲、螺旋CT血管造影、MR血管造影等檢查。由于早期新鮮血栓的超聲回聲與血液回聲基本相似,多普勒超聲對新鮮血栓的檢出率受限；血管造影等非特異性成像檢查只有在機體發(fā)生明顯的病理或解剖結(jié)構(gòu)改變時才能檢出異常,對早期急性附壁血栓仍缺乏特異性和敏感性；加之患者早期癥狀較為隱匿

2、,臨床不易察覺,因而在血栓性疾病得到確診時,受累器官或組織往往已發(fā)生不可逆的器質(zhì)性損傷,進(jìn)而錯過最佳治療時期。臨床迫切需要一種無創(chuàng)、敏感且具有高特異性的技術(shù)檢測手段對血栓性疾病進(jìn)行早期、快速、準(zhǔn)確、及時的診斷,從而能夠早期、及時地對動靜脈血栓性疾病進(jìn)行治療,以降低患者的死亡率及并發(fā)癥的發(fā)生率。
　　 近年來,出現(xiàn)了一門新興的靶向超聲分子成像技術(shù):它通過對普通超聲微泡表面進(jìn)行特殊處理,將靶向于病變組織特定分子的特異配體(抗體、肽等

3、)連接于普通超聲微泡外殼,構(gòu)建成靶向超聲微泡,使靶向微泡經(jīng)靜脈注入后靶向粘附、聚集并較長時間滯留于靶組織或器官中,再結(jié)合對比超聲檢查,產(chǎn)生分子水平的特異性的“主動性靶向超聲分子成像”。靶向超聲分子成像可在機體未發(fā)生明顯改變時從分子水平無創(chuàng)性早期評價各種組織和器官的病理改變,有高度的特異性和敏感性,有實現(xiàn)對早期血栓診斷與治療的潛能。目前,國際上已有一些實驗室應(yīng)用精-甘-天冬氨酸(RGD)多肽為配體的靶向血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲ

4、a)的超聲微泡成功實現(xiàn)在動物深靜脈和心房心耳中血栓的超聲分子成像,但對于動脈血栓的超聲分子成像研究則鮮有報道。究其因為,除了因為RGD多肽微泡難以抵抗動脈血流高剪切應(yīng)力的沖刷之外,更重要的因為可能是因為在血小板聚集后期GPⅡb/Ⅲa)-Fibrinogen(纖維素)復(fù)合物逐漸陷入或移入血小板小管系統(tǒng),在血小板表面的GPⅡb/Ⅲa)受體明顯減少,使得RGD多肽微泡在動脈血流環(huán)境下難以與其靶標(biāo)GPⅡb/Ⅲa)結(jié)合。因此要實現(xiàn)動脈血栓的超聲分

5、子成像,我們需要在動脈血栓上尋求新的靶點以解決問題。
　　 動脈血栓主要為血小板血栓,在活化血小板上另外存在高度密集的P-選擇素為我們提供了另一選擇。研究顯示,血小板活化后持續(xù)高表達(dá)P-選擇素,在一個活化的血小板膜表面上約有高達(dá)10000個P-選擇素分子表達(dá),密度約為350個/μm2,是公認(rèn)的血小板活化的標(biāo)志。在急性冠脈綜合征、冠脈支架術(shù)后、中風(fēng)及外周動脈疾病等動脈血栓性疾病中,P-選擇素在血小板上的表達(dá)均有異常增高。Merte

6、n等研究發(fā)現(xiàn)在血小板聚集過程中,當(dāng)GPⅡb/Ⅲa)-Fibrinogen復(fù)合物逐漸陷入或移入小管系統(tǒng)后,血小板表面僅留下大量的P-選擇素作為唯一的連接分子,它通過與相鄰血小板表面的硫脂類受體相結(jié)合,使血小板連接形成大而穩(wěn)定的血小板血栓。P-選擇素作為血小板活化后15 min在血小板聚集的連接區(qū)域唯一存在的糖蛋白,在活化血小板上高度密集并持久表達(dá),提示我們可選擇P-選擇素作為動脈血栓的靶標(biāo)。
　　 因此,本研究在普通脂質(zhì)微泡的基礎(chǔ)

7、上,通過“抗生物素蛋白/生物素復(fù)合體”的化學(xué)橋接作用將小鼠P-選擇素單克隆抗體連接于脂質(zhì)微泡外殼,構(gòu)建了攜帶P-選擇素單抗的血栓靶向超聲微泡(MBp),創(chuàng)新性將其應(yīng)用于動脈血栓的活體超聲分子成像研究。本研究建立自制的瓊脂糖流動腔模型(模擬體內(nèi)高剪切應(yīng)力血流環(huán)境)和小鼠腹主動脈早期血栓模型,應(yīng)用MBp與對比超聲(CEU)檢查相結(jié)合,分別對體外制備的血栓以及小鼠腹主動脈早期血栓進(jìn)行靶向超聲分子成像,評價其效果,旨在探索可實現(xiàn)動脈早期血栓超聲

8、分子成像的有效超聲分子探針。
　　 材料和方法
　　 1.超聲微泡的制備及理化性質(zhì)鑒定:各種脂質(zhì)材料按一定比例75℃水浴溶解于適量蒸餾水中,同時通全氟丙烷(C3F8)氣體,超聲振蕩至形成乳白色液體,靜置棄下清液并加入等量蒸餾水以去除未結(jié)合脂質(zhì)(重復(fù)4次)。按一定比例加入抗生蛋白鏈菌素,靜置棄下清液2次,按一定比例加入生物素化抗小鼠P-選擇素單克隆抗體,靜置過夜后棄下清液2次。同樣方法將同型IgG抗體連接在生物素化脂質(zhì)微泡

9、表面,得到同型對照微泡(MB)。將微泡置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。在普通光學(xué)顯微鏡下動態(tài)觀察微泡的穩(wěn)定性,采用庫爾特計數(shù)儀測量MBp和MB的粒徑分布及濃度。
　　 2.采用平行板流動腔技術(shù)體外評價MBp與小鼠P-選擇素Fc段(RecombinantMouse P-Selectin/Fc Chimera,PSFc)的靶向黏附效能。
　　 2.1.結(jié)合實驗:將200μl的PSFc(1000 ng/ml)包被于平行板流動腔的聚苯乙烯

10、培養(yǎng)皿上,等量的MBp和MB(5×106/ml)分別經(jīng)微量注射泵以4 dyn/cm2的高剪切應(yīng)力流速通過平行板流動腔(n=3),自顯微鏡下觀察到有微泡出現(xiàn)后開始連續(xù)錄像6 min,動態(tài)觀察每分鐘微泡與包被于聚苯乙烯培養(yǎng)皿上的PSFc的靶向結(jié)合情況；以“0ng/ml PSFc包被(空白組)”為對照。
　　 2.2.解離實驗:平行板流動腔以200μl的PSFc(1000ng/ml)包被,流動腔內(nèi)分別注入5×106/ml MBp或MB

11、0.2 ml后靜置5 min,先以PBS液(極低剪切應(yīng)力0.2 dyn/cm2條件下)沖洗掉靜止但未結(jié)合的微泡,待鏡下無游離的微泡后,每30 s逐漸增加1次剪切應(yīng)力,直至微泡完全解離。20倍物鏡在固定的視野下全程錄像、拍照。
　　 3.應(yīng)用瓊脂糖流動腔模型體外評價MBp靶向血栓效能:自制瓊脂糖流動腔模型,將體外制備的新鮮血栓分別懸掛固定在瓊脂糖流動腔模型中,將等量的MBp和同型對照微泡(MB)隨機先后注入自制瓊脂糖流動腔模型內(nèi),

12、與血栓孵育30 min后,PBS液15 cm/s流速不間斷沖洗血栓,分別在沖洗血栓2、4、6、8、10 min時行對比超聲檢查并測量血栓聲強度(Ⅵ)值。根據(jù)注入超聲微泡的不同分為MBp組和MB組。
　　 4.小鼠腹主動脈早期血栓模型的制備及CEU檢查:實驗小鼠常規(guī)麻醉后,開腹后采用血管內(nèi)膜損傷法制成小鼠腹主動脈不完全栓塞的早期急性血栓模型。3 h后已制備腹主動脈血栓模型的小鼠隨機先后注入等量MBp和MB后行CEU檢查,并根據(jù)注入

13、超聲微泡的不同分為MBp組和MB組。行CEU時,保持探頭位置和超聲各項參數(shù)在整個實驗過程中不變(參數(shù)設(shè)置同體外實驗)。每只小鼠采用微量加樣器經(jīng)尾靜脈隨機先后注射MB和MBp的數(shù)量約為10×106個(間隔30 min)。在注入微泡6 min后行對比超聲,獲取第一幀圖像后給予高機械指數(shù)的連續(xù)超聲發(fā)射2-3 s以破壞微泡,繼續(xù)存儲本底圖像2-3幀,全部聲學(xué)造影圖像存于CD盤,以備脫機分析。第一幀圖像聲強度代表微泡在觀察區(qū)的總濃度,包括粘附在血

14、栓上的粘附微泡和血池中的循環(huán)微泡；微泡破壞后存儲圖像上的Ⅵ值則代表血池中循環(huán)微泡的濃度；前者減去后者則得到粘附在血栓中微泡的濃度。
　　 5.CEU圖像分析:取圖結(jié)束后,應(yīng)用MCE分析軟件對所得圖像進(jìn)行分析,測量PBS液沖洗2、4、6、8、10 min血栓的Ⅵ值和小鼠腹主動脈血栓的Ⅵ值,采用彩色編碼技術(shù)制作血栓顯影的彩色編碼圖像,紅色、橙色和藍(lán)色依次代表血栓顯影的強度由強到弱。
　　 6.病理學(xué)檢測:圖像采集完成后,取體

15、外血栓及小鼠腹主動脈迅速做冷凍切片,行HE染色及免疫組化檢查。
　　 7.統(tǒng)計學(xué)分析:使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,差異性檢驗水準(zhǔn)為α=0.05(雙側(cè))。
　　 結(jié)果
　　 1.超聲微泡制備情況:顯微鏡下觀察MB和MBp均為透亮微氣泡,大小形態(tài)一致。采用庫爾特計數(shù)儀測得MB的平均粒徑為2.4±0.3μm,濃度約(5.5～6.8)×108個/ml；MBp的平均粒徑為2.6±0.

16、4μm,濃度約為(2.8～4.2)×108個/ml。
　　 2.采用平行板流動腔技術(shù)體外評價微泡與小鼠P-選擇素Fc段(PSFc)的靶向黏附效能
　　 2.1.平行板流動腔結(jié)合實驗顯示,在模擬動脈生理血流條件的高剪切應(yīng)力(4.0 dyn/cm2)下MBp可與包被于平行板流動腔的PSFc有效結(jié)合,6 min后每個視野中仍可見較多粘附的靶向微泡,為(43.00±4.00)個/視野,顯示了很好的主動性靶向黏附效能,在空白對照組

17、中MBp幾乎不能與PSFc結(jié)合；而MB不論在空白對照組還是PSFc包被組均不能與平行板流動腔結(jié)合。
　　 2.2.平行板流動腔解離實驗顯示,MBp能夠抵抗PBS液一定剪切應(yīng)力的沖刷,MBp半數(shù)解離時剪切應(yīng)力達(dá)到(28.13±4.24)dyn/cm2,微泡完全解離時剪切應(yīng)力高達(dá)(96.51±2.71)dyn/cm2；而MB半數(shù)解離時及完全解離時剪切應(yīng)力僅有(7.18±1.44 dyn/cm2,P=0.001 vs MBp)和(25

18、.52±2.21 dyn/cm2,P=0.000vs MBp)。
　　 3.體外血栓CEU顯影圖像及Ⅵ值分析:體外血栓與MBp孵育后經(jīng)PBS液沖洗各時間點的CEU圖像均可見顯著的血栓超聲顯影；而血栓與MB孵育后經(jīng)PBS液沖洗各時間點的血栓CEU圖像顯影強度較前者明顯減弱。沖洗10 min后MBp組血栓仍有可視性對比增強,而MB組血栓在沖洗2 min后已無可視性對比增強。沖洗前血栓Ⅵ值MBp組和MB組無顯著差異(P>0.05)。沖

19、洗后的血栓Ⅵ值在各時間點MBp組均較MB組大,組間有顯著性差異(P=0.000)。
　　 4.小鼠腹主動脈血栓CEU檢查結(jié)果及Ⅵ值分析:小鼠腹主動脈血栓CEU彩色編碼圖像顯示MBp組的血栓顯影顯著增強,而MB組的血栓顯影幾無增強。應(yīng)用MCE圖像軟件分析,測量得MBp組血栓的Ⅵ值高達(dá)(20.91±2.17)U,而MB組血栓的Ⅵ值僅為(8.18±2.25)U,兩組間有顯著性差異(t=14,449,P=0.000)。
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20、.血栓病理學(xué)檢測:體外血栓及小鼠腹主動脈血栓HE染色切片可見大量淡紅色血小板小梁形成,提示其為富含血小板血栓；免疫組化顯示血栓表面有明顯的P-選擇素表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1.體外瓊脂糖流動腔實驗表明MBp在高剪切應(yīng)力條件下與血栓的靶向結(jié)合穩(wěn)定可靠,具有較好的血栓靶向效能,MBp與血栓靶向結(jié)合后可抵抗一定的剪切應(yīng)力沖刷。
　　 2.在體實驗表明應(yīng)用P-選擇素靶向超聲分子成像可有效評價小鼠腹主動脈血栓形成,可望為