攜VCAM-1單抗磁性靶向微泡評價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊早期炎癥.pdf

1、目的:
　　 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(Atherosclerosis Plaque)破裂是引發(fā)心肌梗死、腦血栓等心腦血管急性事件的主要原因。然而,動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展是個(gè)無聲無息的慢性過程,大部分心腦血管事件發(fā)作前都沒有先兆表現(xiàn)。因此,早期診斷動(dòng)脈粥樣硬化斑塊有著十分重要的臨床意義。但是目前臨床尚無早期識別和評價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的有效手段。其中,血管炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展方面扮演著非常重要的角色。如能無創(chuàng)性的對“斑

2、塊炎癥”/“血管炎癥”進(jìn)行靶向分子成像,無疑可為臨床早期診斷動(dòng)脈粥樣硬化斑塊并對其進(jìn)行危險(xiǎn)分層提供非常有價(jià)值的手段,進(jìn)而指導(dǎo)早期的干預(yù)治療,避免或延緩事件的發(fā)生。因此,現(xiàn)有的無創(chuàng)性影像技術(shù),如:超聲、MRI、CT、SPECT等均在對“斑塊炎癥”/“血管炎癥”的靶向分子成像進(jìn)行積極探索。
　　 超聲分子影像技術(shù)(Ultrasound Molecular Imaging)是對粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異分子進(jìn)行靶向性對比超聲成像(Co

3、ntrast-Enhanced UltrasoundImaging)。該技術(shù)通常應(yīng)用靶向性超聲微泡(Targeted Microbubbles)作為示蹤劑,這種靶向性超聲微泡既具有與紅細(xì)胞相似的流變學(xué)特征,可順利的通過組織微循環(huán),又可與特異性靶向分子有效的結(jié)合,從而達(dá)到特異性評價(jià)循環(huán)系統(tǒng)血管內(nèi)皮細(xì)胞上分子學(xué)變化或?qū)崿F(xiàn)檢測循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)固定的靶分子的目的。臨床上有望用于評價(jià)血管內(nèi)皮炎癥、檢測血栓形成或早期發(fā)現(xiàn)腫瘤等領(lǐng)域。而實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的核心就是

4、構(gòu)建有效、特異的靶向超聲微泡。目前常用的靶向超聲微泡主要是通過主動(dòng)性靶向機(jī)制,采用具有脂質(zhì)外殼含惰性氣體的微泡在其表面上裝配特異性配體來實(shí)現(xiàn)。抗體、多肽和多糖等多種分子物質(zhì)均可作為配體與超聲微泡連接構(gòu)建成特異的靶向性超聲微泡。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊被認(rèn)為是一種慢性的炎癥過程,在斑塊發(fā)生發(fā)展的早期有大量的慢性炎癥因子VCAM-1的表達(dá),若能以其為靶點(diǎn)進(jìn)行構(gòu)建靶向超聲微泡,將有望實(shí)現(xiàn)超聲分子影像技術(shù)對斑塊早期炎癥的早期診斷。然而,

5、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊位于高剪切應(yīng)力的血流狀態(tài)下,靶向超聲微泡如何與動(dòng)脈斑塊內(nèi)皮細(xì)胞上的靶分子有效結(jié)合,進(jìn)而對動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的慢性炎癥過程進(jìn)行靶向超聲分子成像?這是目前國際上亟待解決的難題。
　　 為了實(shí)現(xiàn)動(dòng)脈系統(tǒng)的超聲分子成像,人們通過“雙配體”連接技術(shù)構(gòu)建靶向超聲微泡增加靶向微泡的快速黏附以及使用超聲輻射力改變微泡在血管內(nèi)的“軸流”等方式進(jìn)行了相關(guān)嘗試,但均存在一些問題使其并未能很好的進(jìn)行推廣。在本課題組前期靶向超聲分子成像研究

6、成果基礎(chǔ)上,我們假設(shè)將磁性靶向?qū)Ш郊夹g(shù)引入靶向超聲微泡的制備中,制備出攜帶磁性物質(zhì)和配體的靶向性超聲微泡,通過磁性導(dǎo)航可以改變靶向性超聲微泡在大中動(dòng)脈中的軸向分布特征,引導(dǎo)靶向性超聲微泡向成像目標(biāo)(動(dòng)脈)的管壁貼近并停留,進(jìn)而有助于實(shí)現(xiàn)動(dòng)脈系統(tǒng)的靶向超聲分子成像。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊早期炎癥的識別是心血管領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn),目前臨床缺乏有效的評價(jià)手段。由于現(xiàn)有的靶向性超聲微泡難以高效的結(jié)合在高剪切應(yīng)力的大中動(dòng)脈炎癥斑塊上,阻礙了

7、無創(chuàng)、簡便的超聲分子影像技術(shù)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊早期炎癥評價(jià)中發(fā)揮作用。因此,本研究目的在于:應(yīng)用生物素.親和素橋接法制備出攜VCAM-1單抗磁性靶向超聲微泡(Magnetic microbubblestargeted to VCAM-1,MBv),在體和體外實(shí)驗(yàn)評價(jià)其靶向粘附效果,及其用于評價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊早期炎癥的可行性。從而可為靶向超聲微泡的構(gòu)建提供新的思路和方法,為實(shí)現(xiàn)從分子水平無創(chuàng)性的評價(jià)動(dòng)脈斑塊炎癥、早期識別斑塊提供簡便的手

8、段,以指導(dǎo)預(yù)后。
　　 方法:
　　 一、模擬動(dòng)脈間歇脈搏血流評價(jià)攜VCAM-1單抗靶向微泡黏附效能
　　 1、攜VCAM—1單抗靶向微泡(Microbubbles targeted to VCAM-1,MBv)的制備及理化性質(zhì)鑒定
　　 通過聲振法制備生物素化脂質(zhì)超聲微泡(Biotinayted microbubbles,MBb),通過生物素-親和素橋接法先后加入鏈親和素及生物素化抗小鼠VCAM-1單克

9、隆抗體或同型抗體制備MBv及同型對照微泡(Microbubbles with isotypeantibodies.MBi)。庫爾特粒子計(jì)數(shù)儀檢測微泡的粒徑分布及濃度。
　　 2、平行板流動(dòng)腔法評價(jià)MBv在間歇脈搏血流的靶向黏附
　　 應(yīng)用1000ng/ml小鼠VCAM-1 Fc段包被的聚苯乙烯培養(yǎng)皿作為平行板流動(dòng)腔體外檢測微泡粘附穩(wěn)定性的平臺。MBv(5×106/ml)經(jīng)微量注射泵分兩組(持續(xù)滴注組和間歇滴注組)以不同剪

10、切應(yīng)力(0.5—16 dyn/cm2)通過以1000ng/ml VFc包被的平行板流動(dòng)腔,鏡下觀察有微泡出現(xiàn)后錄像6 min,觀察每分鐘微泡的靶向結(jié)合情況。并采用解離實(shí)驗(yàn),每30秒倍增剪切應(yīng)力(0.2-51.2dyn/cm2),檢測MBv微泡達(dá)半數(shù)解離時(shí)的剪切應(yīng)力。
　　 3、利用SPSS13.0軟件經(jīng)行數(shù)據(jù)處理,兩組微泡在不同剪切應(yīng)力下每分鐘結(jié)合的微泡個(gè)數(shù)之間比較采用單因素方差分析,微泡解離實(shí)驗(yàn)仍結(jié)合微泡百分?jǐn)?shù)間比較用重復(fù)測量

11、的方差分析,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 二、攜VCAM-1單抗靶向微泡評價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊早期炎癥
　　 1、動(dòng)物分組及模型準(zhǔn)備
　　 小鼠分為4組:APOE小鼠高膽固醇飼養(yǎng)組(APOE-HCD組)、APOE小鼠普通飲食組(APOE-RD組),C57小鼠高膽固醇飼養(yǎng)組(C57-HCD組)和C57小鼠普通飲食組(C57-RD組)。
　　 2、小鼠腹主動(dòng)脈CEU檢查
　　 所有實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后分別

12、隨機(jī)(間隔30分鐘)經(jīng)靜脈彈丸注射法給予MBv和MBi,CEU檢查采用CPS成像技術(shù)進(jìn)行,探頭發(fā)射和接收頻率分別為7.0和15 MHz,用低機(jī)械指數(shù)(MI=0.18)進(jìn)行連續(xù)CEU觀察8分鐘并取圖后給予高機(jī)械指數(shù)(MI=1.9)連續(xù)脈沖破壞3秒后取本底圖像,所有圖像均測量聲強(qiáng)度(Video intensity,Ⅵ)并進(jìn)行彩色編碼處理。
　　 3、小鼠腹主動(dòng)脈免疫組化檢查
　　 小鼠超聲成像后處死行腹主動(dòng)脈免疫組化檢測VC

13、AM-1在管腔內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)；采用EnVision兩步法檢測,按操作說明書行常規(guī)脫蠟水合、抗原修復(fù)、一抗及二抗孵育、DAB染色及蘇木素復(fù)染、最后脫水、透明、中性樹膠封片,于顯微鏡下觀察并拍照。
　　 4、利用SPSS13.0軟件經(jīng)行數(shù)據(jù)處理,小鼠腹主動(dòng)脈超聲參數(shù)比較用單因素方差分析,兩種微泡在不同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組之間的聲強(qiáng)度比較用兩因素方差分析,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、攜VCAM-1單抗磁性靶向微泡的制備及體外評

14、價(jià)
　　 1、MBvM的制備及理化性質(zhì)鑒定
　　 通過生物素-親和素橋接法利用磁性鏈親和素制備磁性靶向微泡MBvM及磁性同型對照微泡(Magnetic microbubbles with isotype antibodies,MBiM)。庫爾特粒子計(jì)數(shù)儀檢測微泡的粒徑分布及濃度。
　　 2、熒光顯微鏡觀察微泡的磁響應(yīng)性
　　 用DiI熒光MBb進(jìn)行制備MBvM、MBv及MBiM,將微泡懸液吸出少許并用蒸餾

15、水稀釋后滴在玻片上,加上蓋片后靜置3分鐘行熒光顯微鏡觀察并照相。并用外置永磁鐵在玻片一側(cè)作用,熒光顯微鏡繼續(xù)觀察并錄像。
　　 3、平行板流動(dòng)腔法評價(jià)磁性微泡的磁響應(yīng)性及靶向黏附
　　 A、平行板流動(dòng)腔模型判斷微泡磁響應(yīng)性
　　 MBvM、MBv和MBiM經(jīng)微量注射泵以不同剪切應(yīng)力(1-24 dyn/cm2)通過以1000 ng/ml VFc包被的平行板流動(dòng)腔,各組均分別分為磁場作用組及無磁場作用組；給予鏡下觀察

16、有微泡出現(xiàn)后錄像5min,觀察每分鐘微泡的靶向結(jié)合情況,取第5分鐘點(diǎn)計(jì)數(shù)視野內(nèi)黏附微泡的個(gè)數(shù)進(jìn)行比較。
　　 B、平行板流動(dòng)腔模型判斷磁性微泡黏附效能
　　 MBvM、MBv和MBiM經(jīng)微量注射泵以不同剪切應(yīng)力(1-24 dyn/cm2)通過以1000 ng/ml VFc包被的平行板流動(dòng)腔,各組均先給予磁場作用5分鐘,之后取消磁場作用并繼續(xù)沖刷5分鐘；觀察每分鐘微泡的靶向結(jié)合情況,取第5分鐘點(diǎn)計(jì)數(shù)視野內(nèi)黏附微泡的個(gè)數(shù)及第

17、10分鐘點(diǎn)計(jì)數(shù)視野內(nèi)黏附微泡個(gè)數(shù)進(jìn)行比較。
　　 4、利用SPSS13.0軟件經(jīng)行數(shù)據(jù)處理,每組微泡不同剪切應(yīng)力下每分鐘結(jié)合的微泡個(gè)數(shù)之間比較采用具有一個(gè)重復(fù)測量因素兩因素方差分析,微泡解離實(shí)驗(yàn)仍結(jié)合微泡百分?jǐn)?shù)間比較用重復(fù)測量的方差分析,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 四、攜VCAM-1單抗磁性靶向微泡評價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊早期炎癥
　　 1、動(dòng)物分組及模型準(zhǔn)備
　　 小鼠分為4組:APOE小鼠高膽固醇飼

18、養(yǎng)組(APOE-HCD組)、APOE小鼠普通飲食組(APOE-RD組),C57小鼠高膽固醇飼養(yǎng)組(C57-HCD組)和C57小鼠普通飲食組(C57-RD組)。
　　 2、小鼠腹主動(dòng)脈CEU檢查
　　 所有實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后分別隨機(jī)(間隔30分鐘)經(jīng)靜脈彈丸注射法給予MBvM、MBv和MBiM(均約4×106個(gè)),小鼠背部下方放置5000GS強(qiáng)磁鐵,微泡注射5分鐘后取出,CEU觀察10分鐘并取圖后給予高機(jī)械指數(shù)(MI=1.9)

19、連續(xù)脈沖破壞3秒后取本底圖像,所有圖像均測量聲強(qiáng)度(video intensity,Ⅵ)并進(jìn)行彩色編碼處理。
　　 3、利用SPSS13.0軟件經(jīng)行數(shù)據(jù)處理,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組中三種微泡視頻強(qiáng)度比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析,微泡在各實(shí)驗(yàn)組間的比較采用兩因素方差分析,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、模擬動(dòng)脈間歇脈搏血流評價(jià)攜VCAM-1單抗靶向微泡黏附效能
　　 1、MBv的制備及理化性質(zhì)鑒定

20、
　　 庫爾特檢查示制備出的MBv的平均粒徑約為(2.55±0.75)μm,濃度約為2.9×108個(gè)/ml。粒徑分布均勻,大部分微泡集中在2-4μm之間。
　　 2、平行板流動(dòng)腔法評價(jià)MBv在間歇脈搏血流的靶向黏附
　　 平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)顯示MBv在連續(xù)輸注組在0.5-2 dyn/cm2時(shí)能與VFc包被的平行板流動(dòng)腔有明顯的結(jié)合。逐漸增加剪切應(yīng)力(2-16 dyn/cm2)可見MBv的結(jié)合明顯下降,在4 dyn/

21、cm2后就難以看到靶向微泡的有效結(jié)合；
　　 而在間歇輸注組,MBv在各個(gè)剪切應(yīng)力的靶向結(jié)合效率均明顯較連續(xù)輸注組高(P<0.05),其中在2 dyn/cm2時(shí)微泡的靶向結(jié)合效率最高,在4 dyn/cm2和8 dyn/cm2時(shí)仍見靶向微泡有效的結(jié)合,至16 dyn/cm2時(shí)仍見少量的靶向微泡結(jié)合。
　　 解離實(shí)驗(yàn)顯示平行板流動(dòng)腔包被分組與剪切應(yīng)力間存在交互作用(F=529.695,P<0.001),并可見MBv在1000

22、 ng/ml VFc包被組更能抵抗血流剪切應(yīng)力(F=12.011,P<0.001),達(dá)半數(shù)解離的剪切應(yīng)力為(22.1±2.6)dyn/cm2,而在極高剪切應(yīng)力(51.2 dyn/cm2)時(shí)仍能有微泡的滯留；在封閉組和空白組,MBv均無法有效結(jié)合,極低剪切應(yīng)力即可導(dǎo)致大部分MBv解離。
　　 二、攜VCAM-1單抗靶向微泡評價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊早期炎癥
　　 1、小鼠CEU檢查前后生命體征比較
　　 各組小鼠腹主動(dòng)脈

23、峰值血流速度,主動(dòng)脈內(nèi)徑,以及心率等無顯著差異。
　　 2、小鼠腹主動(dòng)脈CEU檢查
　　 MBv的CEU圖像顯示APOE-HCD組在微泡注射后8分鐘仍可見明顯的腹主動(dòng)脈超聲顯影,而其他小鼠腹主動(dòng)脈超聲顯影情況不明顯；MBi在各動(dòng)物分組8分鐘時(shí)均無明顯腹主動(dòng)脈的超聲顯影增強(qiáng)。
　　 彩色編碼代表圖像顯示,APOE-HCD組8分鐘后扣除本底的MBv成像彩色編碼后較其它各組及各種微泡成像均明顯增強(qiáng),APOE-RD和C5

24、7-HCD組也可見8分鐘后扣除本底的MBv成像較對照微泡稍增強(qiáng),C57-RD組MBv及MBi均不增強(qiáng)。
　　 對Ⅵ進(jìn)行定量分析后,微泡分組和動(dòng)物分組問存在交互效應(yīng),其中APOE-HCD-MBv組(10.21±1.60)顯著高于其他各組及應(yīng)用微泡的組合(F=62.203,P<0.001)
　　 3、小鼠腹主動(dòng)脈免疫組化檢查
　　 免疫組化檢測顯示APOE-HCD小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)膜粗糙,表面大量表達(dá)VCAM-1,而AP

25、OE-RD組和C57-HCD組也有少量VCAM-1表達(dá),C57-RD小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑,未見有VCAM-1表達(dá)。
　　 三、攜VCAM-1單抗磁性靶向微泡的制備及體外評價(jià)
　　 1、MBvM的制備及理化性質(zhì)鑒定
　　 庫爾特計(jì)數(shù)儀檢測顯示無論加入磁性還是非磁性親和素為橋接,制備的靶向磁性微泡(MBvM)及非磁性靶向微泡(MBv)及對照微泡均(MBiM)的粒徑分布和濃度均與生物素化脂質(zhì)微泡(MBb)無顯著差異,證

26、明加入磁性親和素材料并不影響微泡的穩(wěn)定性。
　　 2、熒光顯微鏡觀察微泡的磁響應(yīng)性
　　 用外置永磁鐵在玻片一側(cè)作用,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)非磁性靶向微泡MBv在磁場作用下保持靜止?fàn)顟B(tài),而磁性靶向微泡及磁性對照微泡MBvM及MBiM則迅速在磁場作用下趨向磁鐵方向并聚集。
　　 3、平行板流動(dòng)腔法評價(jià)磁性微泡的磁響應(yīng)性及靶向黏附
　　 3.1、在沒有磁場作用下,平行板流動(dòng)腔顯示MBvM與MBv靶向小鼠VCAM-

27、1 Fc段的能力無論在任何剪切應(yīng)力條件下均無顯著性差異(F=0.131,P=0.877),與MBiM對比,兩者只能在低于8dyn/cm2切應(yīng)力條件下與小鼠VCAM-1 Fc段結(jié)合。MBiM在任何剪切應(yīng)力作用下均無法與小鼠VCAM-1 Fc段有效結(jié)合。
　　 3.2、在磁場作用5分鐘后,MBvM在各剪切應(yīng)力下的靶向結(jié)合比MBv及MBiM有顯著性差異(F=70.236,P<0.0001),且能在16-24 dyn/cm2高剪切應(yīng)力的

28、條件下靶向結(jié)合；
　　 3.3、磁場作用5分鐘后,去掉磁場再作用5分鐘,發(fā)現(xiàn)去掉磁場后,在4dyn/cm2以下切應(yīng)力條件下MBvM在10分鐘點(diǎn)的靶向略有增加,而在高切應(yīng)作用下,10分鐘時(shí)靶向黏附微泡的數(shù)量呈下降趨勢,但仍有微泡有效的靶向。
　　 3.4、磁場作用5分鐘后,去掉磁場再作用5分鐘,只有MBvM能在高剪切應(yīng)力(8-24 dyn/cm2)繼續(xù)保持有效的靶向(F=60.398,P<0.0001),而MBiM因?yàn)橐后w

29、的沖刷作用,去掉磁場后無法保持其靶向能力。
　　 四、攜VCAM-1單抗磁性靶向微泡評價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊早期炎癥
　　 1、彩色編碼代表圖像顯示,MBvM磁性靶向微泡在各動(dòng)物分組10分鐘后扣除本底的彩色編碼后均較MBv及MBiM成像明顯增強(qiáng)。
　　 2、對Ⅵ進(jìn)行定量分析后,微泡分組和動(dòng)物分組間存在交互效應(yīng),其中APOE-HCD-MBvM組(28.1±1.8)顯著高于其他各組及應(yīng)用微泡的組合(F=77.545,P<

30、0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 一、靶向VCAM-1的微泡在間歇血流條件下可與VFc在高剪切應(yīng)力的環(huán)境中有效的靶向結(jié)合,從而具有在脈動(dòng)高剪切應(yīng)力狀態(tài)下的動(dòng)脈系統(tǒng)處實(shí)現(xiàn)分子靶向的能力。
　　 二、應(yīng)用攜VCAM-1單抗靶向微泡可對小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的早期炎癥進(jìn)行超聲分子成像,但仍有進(jìn)一步提高靶向效能的空間。
　　 三、應(yīng)用生物素-親和素橋接法構(gòu)建攜VCAM-1單抗磁性靶向微泡,體外磁場作用下驗(yàn)證了其磁