攜Sialyl Lewisx和P-選擇素單抗雙配體超聲微泡在高剪切力下靶向粘附性能的評(píng)價(jià).pdf

1、背景和目的：
　　 血管內(nèi)皮炎癥已被證實(shí)與許多心血管疾病,如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、高血壓等的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。如能無(wú)創(chuàng)性地對(duì)“血管炎癥”進(jìn)行靶向分子成像,無(wú)疑可為臨床早期診斷心血管疾病提供非常有價(jià)值的手段,進(jìn)一步指導(dǎo)早期的干預(yù)、治療。因此,現(xiàn)有的許多無(wú)創(chuàng)性影像技術(shù),如:超聲、MRI、CT、SPECT等均在對(duì)“血管炎癥”的靶向分子成像進(jìn)行積極探索。
　　 靶向超聲分子成像作為近年興起的一門無(wú)創(chuàng)性分子影像

2、技術(shù),是通過(guò)在超聲微泡表面連接特異性配體構(gòu)建靶向微泡,以靶向微泡作為示蹤劑,經(jīng)靜脈注入后與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性靶向分子有效結(jié)合,再通過(guò)對(duì)局部靶向粘附的微泡行超聲對(duì)比成像,特異性評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮細(xì)胞上分子學(xué)變化,從而實(shí)現(xiàn)疾病分子水平上特異診斷的目的。與其他依靠解剖結(jié)構(gòu)和組織生理學(xué)改變來(lái)發(fā)現(xiàn)和診斷疾病的傳統(tǒng)影像學(xué)技術(shù)相比較,超聲分子成像技術(shù)具有實(shí)時(shí)、高空間、時(shí)間分辨率,無(wú)放射污染,儀器便攜、價(jià)廉等先進(jìn)性。
　　 許多研究表明,血管內(nèi)皮

3、細(xì)胞功能異常作為血管炎癥反應(yīng)過(guò)程必要的參與因素,是以內(nèi)皮細(xì)胞表面P-(platelet-selectin)、E-(endothelial-selectin)和L-(leukocytes-selectin)選擇素,血管粘附分子VCAM-1(vascular adhesionmolecule-1)和細(xì)胞間粘附因子ICAM-I(intracellular adhesion molecule-1)等的明顯上調(diào)為特征的。這些粘附因子介導(dǎo)炎癥細(xì)胞實(shí)

4、現(xiàn)在血管內(nèi)皮表面滾動(dòng)、牢固結(jié)合及向內(nèi)皮下遷移,其表達(dá)往往具有區(qū)域特異性和特異疾病關(guān)聯(lián)性。若能實(shí)現(xiàn)對(duì)這些異常表達(dá)粘附因子的靶向檢測(cè),有望在早期評(píng)價(jià)血管炎癥反應(yīng)和相關(guān)疾病。而超聲分子影像技術(shù)可通過(guò)在超聲微泡表面連接與內(nèi)皮特異因子靶向結(jié)合的配體,介導(dǎo)微泡與靶分子有效結(jié)合,再行對(duì)比超聲成像,具有對(duì)“血管炎癥”進(jìn)行靶向分子成像的潛能。
　　 毫無(wú)疑問(wèn),靶向超聲微泡與血管內(nèi)皮表面靶分子的有效結(jié)合是實(shí)現(xiàn)超聲分子成像的核心和關(guān)鍵,而靶向微泡表面

5、配體的選擇對(duì)其粘附效能具有重要的影響。目前常用的靶向超聲微泡主要是通過(guò)主動(dòng)性靶向機(jī)制,采用具有脂質(zhì)外殼含惰性氣體的微泡在其表面上裝配特異性配體來(lái)實(shí)現(xiàn)?？贵w、多肽和多糖等多種分子物質(zhì)均可作為配體與超聲微泡連接構(gòu)建成特異的靶向性超聲微泡。國(guó)內(nèi)外已有許多研究通過(guò)在微泡表面攜帶與血管粘附因子特異性結(jié)合的單克隆抗體構(gòu)建靶向超聲微泡,成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)血栓、心臟缺血再灌注等血管炎癥相關(guān)性疾病的超聲分子影像評(píng)價(jià)。但是,由于大部分抗體與靶分子的結(jié)合和解離速率

6、低、作用過(guò)程相對(duì)緩慢,形成牢固結(jié)合需要一定的接觸時(shí)間,而血流速度快、剪切應(yīng)力大,微泡與靶分子的接觸時(shí)間短暫,在尚未形成牢固結(jié)合前可被血流沖刷脫離而難以達(dá)到高效結(jié)合,這使得應(yīng)用攜帶單一抗體的靶向超聲微泡目前僅能對(duì)血流速度慢、剪切應(yīng)力小的靜脈系統(tǒng)疾病進(jìn)行良好靶向超聲分子影像評(píng)價(jià),嚴(yán)重限制了靶向超聲分子成像技術(shù)在動(dòng)脈系統(tǒng)中的應(yīng)用,而大多數(shù)與心血管疾病相關(guān)的病理過(guò)程都發(fā)生在動(dòng)脈中。
　　 因此,要實(shí)現(xiàn)超聲微泡在動(dòng)脈系統(tǒng)有效的靶向結(jié)合需要

7、微泡在高剪切應(yīng)力下具有與靶分子快速粘附和牢固結(jié)合的特點(diǎn)。若能利用具有靶向誘導(dǎo)作用的“雙配體”連接技術(shù),設(shè)計(jì)在同一超聲微泡上連接兩種配體,一種是可與靶分子快速結(jié)合的配體,另一種是可與靶分子穩(wěn)定結(jié)合的配體,有望實(shí)現(xiàn)高剪切應(yīng)力下微泡的有效靶向結(jié)合。
　　 近期發(fā)現(xiàn)一種非抗體型的配基Sialyl Lewisx能與選擇素快速但不十分牢固地結(jié)合,于炎癥早期介導(dǎo)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮表面滾動(dòng),它可以為某些緩慢結(jié)合型配基形成牢固結(jié)合提供機(jī)會(huì)。因此,本

8、實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建同時(shí)攜Sialyl Lewisx和P-選擇素單抗的雙配體靶向超聲微泡,利用平行板流動(dòng)腔評(píng)價(jià)其在高剪切應(yīng)力下的靶向黏附行為特征和粘附效能,并在小鼠腹主動(dòng)脈炎癥模型上,結(jié)合對(duì)比超聲評(píng)價(jià)其分子成像效果,探討具有靶向誘導(dǎo)作用特點(diǎn)的“雙配體”能否介導(dǎo)靶向微泡實(shí)現(xiàn)從滾動(dòng)到牢固黏附的高效結(jié)合,為發(fā)展在高剪切應(yīng)力下具有更好黏附效能的靶向超聲微泡構(gòu)建技術(shù),進(jìn)而開(kāi)拓超聲分子影像技術(shù)在評(píng)價(jià)動(dòng)脈炎癥反應(yīng)中的應(yīng)用領(lǐng)域提供可行性指導(dǎo)。
　　 方

9、法
　　 1、生物素化脂質(zhì)超聲微泡的制備:將各種脂質(zhì)材料及輔助材料(DSPE-PEG2000-Biotin、DPPC、PEG4000等)按一定比例加入適量蒸餾水中水浴溶解后,通入全氟丙烷(C3F8)氣體,剪切儀高速剪切至形成乳白色液體制備生物素化脂質(zhì)微泡,靜置、洗滌、純化3次后,顯微鏡下觀察并利用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀檢測(cè)其大小及濃度。
　　 2、靶向超聲微泡的制備:生物素化的脂質(zhì)超聲微泡制備后,加入一定量的抗生蛋白鏈菌素,靜置后

10、洗滌、純化3次,分別按1×107個(gè)微泡1.5μg、7.5μg和7.5μg比例依次加入Sialyl Lewisx、P-選擇素單抗、同型對(duì)照單抗制備分別攜Sialyl lewisx(Selectin-targeted microbubbles,MBS)、P-選擇素單抗(P-selectin—targeted microbubbles,MBP)和同型對(duì)照單抗(isotype controlmicrobubbles,MBC)三種靶向超聲微泡,并

11、按1×107個(gè)微泡加入0.75μg SialylLewisx和3.75μg P-選擇素單抗比例同時(shí)加入兩種配體制備出攜Sialyl Lewisx和P-選擇素單抗的雙配體靶向超聲微泡(Dual-liglands microbubbles,MBD),每種微泡制備后靜置、洗滌、純化3次,經(jīng)庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀檢測(cè)其大小及濃度。
　　 3、靶向超聲微泡的體外鑒定:每種靶向微泡均取5×106個(gè)稀釋至1ml,與Sialyl Lewisx抗體(CD1

12、5s)作用后,同時(shí)與FITC(綠色)標(biāo)記的抗大鼠二抗和TRITC(紅色)標(biāo)記的抗小鼠二抗孵化,洗滌、純化后連續(xù)于顯微鏡常光、紅色和綠色光譜的光照作用下觀察拍照；并以MBC作對(duì)照,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MBS、MBP和MBD的配體結(jié)合率。
　　 4、平行板流動(dòng)腔法體外評(píng)價(jià)超聲微泡的靶向粘附性能:配備濃度為1μg/ml的小鼠P-選擇素FC段溶液,按200μl/個(gè)滴加在每個(gè)培養(yǎng)皿中央進(jìn)行包被。
　　 4.1、結(jié)合實(shí)驗(yàn):利用平行板流動(dòng)

13、腔分別設(shè)定0.5、2.0和4.0 dyn/cm2三種剪切應(yīng)力。同一剪切應(yīng)力下,每種微泡(約5×106個(gè)/ml)分別經(jīng)微量注射泵作用通過(guò)平行板流動(dòng)腔,顯微鏡下錄像觀察6分鐘。
　　 4.2、解離實(shí)驗(yàn):每種微泡(約5×106個(gè)/ml)取1ml,分別注入平行板流動(dòng)腔培養(yǎng)皿后靜置5分鐘,先以0.9％生理鹽水以0.2 dyn/cm2剪切力沖洗掉靜止但未結(jié)合的微泡,至鏡下無(wú)游離的微泡后,每30秒增加一次剪切應(yīng)力,至鏡下微泡完全解離。

14、　　 4.3、利用image-pro-plus圖像分析軟件,分析每種剪切引力下瞬時(shí)滾動(dòng)的微泡數(shù)目、6分鐘時(shí)視野內(nèi)牢固結(jié)合的微泡數(shù)目和解離實(shí)驗(yàn)中每次剪切應(yīng)力增加后30秒視野內(nèi)仍牢固結(jié)合的微泡數(shù)目。
　　 5、小鼠腹主動(dòng)脈炎癥模型的制備:12只小鼠隨機(jī)平均分為炎癥組和對(duì)照組,炎癥組小鼠在腎動(dòng)脈分支至髂動(dòng)脈分叉之間的腹主動(dòng)脈周圍注入含0.5μgTNF-α和0.125μg IL-1β的0.3 ml PBS溶液,對(duì)照組小鼠只注入0.3

15、ml PBS溶液,回置腸腔,縫合切口關(guān)閉腹腔作用4小時(shí)。
　　 6、靶向超聲分子成像:制備的小鼠采用經(jīng)尾靜脈隨機(jī)注射MBC、MBS、MBP和MBD(5×107個(gè))(兩次注射間隔30分鐘),6分鐘后行對(duì)比超聲檢查觀察腹主動(dòng)脈的顯影情況,并采用MCE軟件對(duì)所得圖像進(jìn)行分析,測(cè)量小鼠腹主動(dòng)脈造影聲強(qiáng)度(video intensity,VI),編輯主動(dòng)脈顯影的彩色編碼圖像。
　　 7、病理組織和免疫組化染色檢查:超聲分子成像結(jié)束

16、后,立即處死小鼠取腹主動(dòng)脈分別行HE染色和免疫組化染色。
　　 結(jié)果
　　 1、靶向微泡的制備:顯微鏡下觀察MBC、MBS、MBP和MBD均為分布均勻,大小均一的透亮氣泡,應(yīng)用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)得四種微泡的平均粒徑分布為(2.182-2.378)μm,平均濃度分布為(1.239-1.341)×108個(gè)/ml,四種微泡平均粒徑比較(F=0.874,P=0.494)和平均濃度比較(F=0.047,P=0.985)均無(wú)顯著差異。<

17、br>　　 2、靶向微泡的體外鑒定:每種微泡均采用FITC標(biāo)記的羊抗大鼠二抗和TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗孵化并洗滌純化后,在熒光顯微鏡下觀察示,MBC未呈現(xiàn)熒光,MBS只有明顯的紅色熒光,MBP只呈明顯的綠色熒光,而MBD在對(duì)應(yīng)光照作用下分別呈現(xiàn)均勻明顯的紅色和綠色熒光；以MBC作為對(duì)照,經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)得,MBS、MBP和MBD的配體結(jié)合率均在80％以上,三者比較無(wú)顯著差異(F=1.773,P=0.248)。以上均表明利用“生物素-

18、親和素”橋接技術(shù)可使配體與脂質(zhì)微泡有效連接,成功構(gòu)建雙配體靶向微泡和其他同型對(duì)照微泡。
　　 3、平行板流動(dòng)腔法評(píng)價(jià)微泡的靶向粘附性能
　　 3.1、結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示:將MBC、MBS、MBP,和MBD分別在0.5、2.0和4.0 dyn/cm2剪切應(yīng)力下通過(guò)表面包被相同濃度小鼠P-選擇素FC段溶液的平行板流動(dòng)腔時(shí),可觀察到除MBC少量滾動(dòng)和粘附外,MBS、MBP和MBD的滾動(dòng)和結(jié)合數(shù)目均較多。在相同剪切應(yīng)力下,MBS、MB

19、P和MBD的瞬時(shí)滾動(dòng)數(shù)目和全程(6分鐘)結(jié)合數(shù)目均明顯高于MBC(P<0.01)。MBC的瞬時(shí)滾動(dòng)數(shù)目在不同剪切應(yīng)力下無(wú)顯著差異(F=4.287,P=0.070),全程結(jié)合數(shù)目在4.0 dyn/cm2時(shí)均較0.5和2.0dyn/cm2時(shí)減少(F=6.833,P=0.028)；而MBS、MBP和MBD的瞬時(shí)滾動(dòng)數(shù)目和全程結(jié)合數(shù)目均隨剪切應(yīng)力的提高而減少(P<0.05)。其中,在剪切應(yīng)力為0.5dyn/cm2時(shí)示:MBS、MBP和MBD的瞬

20、時(shí)滾動(dòng)數(shù)目比較和全程結(jié)合數(shù)目比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)；在2.0 dyn/cm2時(shí)示:MBS和MBD的瞬時(shí)滾動(dòng)數(shù)目均高于MBP(MBS較MBP:P=0.047:MBD較MBP:P=0.002),而前兩者比較無(wú)顯著差異(P=0.262)；全程結(jié)合數(shù)目由少至多依次為MBP、MBS和MBD(P<0.05)。在4.0 dyn/cm2時(shí)示:MBS和MBD的瞬時(shí)滾動(dòng)數(shù)目均高于MBP(MBS較MBP:P=0.003；MBD較MBP:P=0.01

21、5),而前兩者比較無(wú)顯著差異(P=1.000)；MBD的全程結(jié)合數(shù)均明顯高于MBS和MBP(MBD較MBS:P=0.018；MBD較MBP:P=0.001),后兩者比較無(wú)顯著差異(P=0.455)。以上表明在平行板流動(dòng)腔中,MBS、MBP和MBD均可抵抗一定剪切應(yīng)力流體的沖刷,對(duì)P-選擇素實(shí)現(xiàn)靶向結(jié)合,且MBD在較高剪切應(yīng)力下顯示出優(yōu)于MBS和MBP的靶向結(jié)合效能。
　　 3.2、解離實(shí)驗(yàn)顯示:在包被相同P-選擇素濃度的平行板流

22、動(dòng)腔內(nèi)注入1 ml的微泡后,靜置5分鐘待其與靶分子靶向結(jié)合后,每30秒增加一次剪切應(yīng)力,常光顯微鏡下觀察可見(jiàn),MBC、MBS、MBP和MBD仍結(jié)合于平行板流動(dòng)腔表面的數(shù)目隨著剪切應(yīng)力的增加而減少；其中,MBC不能與P-選擇素穩(wěn)定結(jié)合,在較低剪切應(yīng)力下即可見(jiàn)明顯的解離,MBS、MBP和MBD的結(jié)合相對(duì)穩(wěn)定,能抵擋一定剪切應(yīng)力的沖刷作用。圖像定量分析后顯示:MBC、MBS、MBD和MBP的半數(shù)解離剪切應(yīng)力依次增高,分別為(4.133±0.8

23、3)、(10.20±0.87)、(19.20±1.4)和(29.40±3.54)dyn/cm2(F=91.374,P=0.000)。僅在(14.20±2.82)dyn/cm2時(shí)MBC就達(dá)到完全解離,而MBS、MBD和MBP的完全解離剪切應(yīng)力依次為(29.40±4.26)(67.06±5.46)和(101.80±3.54)dyn/cm2,三者比較依次增高(F=271.389,P=0.000)。表明靶向微泡與靶分子結(jié)合后能夠抵擋一定剪切應(yīng)力

24、的沖刷,其中MBS為不穩(wěn)定結(jié)合,MBD結(jié)合相對(duì)牢固,而MBP一旦結(jié)合就十分牢固,能夠抵擋高剪切應(yīng)力的沖刷。
　　 4、靶向超聲分子成像:分別隨機(jī)經(jīng)尾靜脈注射MBC、MBS、MBP和MBD)6分鐘后,在對(duì)照組小鼠腹主動(dòng)脈中均未見(jiàn)明顯的超聲顯影,在炎癥組小鼠腹主動(dòng)脈中除MBC無(wú)明顯超聲顯影外,MBS、MBP和MBD可呈現(xiàn)不同程度相對(duì)明顯的超聲顯影,其中MBD的顯影較MBS和MBP明顯增強(qiáng)。
　　 5、超聲圖像定量分析:對(duì)采集

25、的超聲圖像進(jìn)行VI定量分析后顯示,除MBC外(t=0.099,p=0.923),MBS、MBP和MBD在炎癥組小鼠中腹主動(dòng)脈中的VI值均高于對(duì)照組(MBD:t=9.363,p=0.000；MBP:t=6.841,p=0.000；MBD:t=8.246,p=0.000)。其中,在對(duì)照組中,MBC、MBS、MBP和MBD的VI值無(wú)顯著差異(F=1.199,P=0.336)；而在炎癥組中,MBS、MBP和MBD的VI值均明顯高于MBC(F=3

26、6.349,P=0.000),且MBD較MBS、MBP顯著增加(P<0.05),后兩者間無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 6、病理組織和免疫組化染色結(jié)果
　　 6.1、HE染色顯示:對(duì)照組小鼠腹主動(dòng)脈無(wú)明顯病理改變,中外膜結(jié)構(gòu)清晰,內(nèi)皮扁平光滑；炎癥組小鼠腹主動(dòng)脈壁水腫增厚,內(nèi)皮皺縮凸向管腔,管腔狹窄,中膜可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞增生、排列紊亂,部分遷入內(nèi)膜下,彈性蛋白收縮明顯,增生斷裂、散落在外膜內(nèi)。
　　 6.2、免

27、疫組化染色顯示:對(duì)照組小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮P-選擇素表達(dá)均為陰性,而炎癥組小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮均可見(jiàn)P-選擇素表達(dá),表明小鼠腹主動(dòng)脈炎癥模型構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論
　　 1、采用“生物素-親和素”橋接技術(shù)可實(shí)現(xiàn)Sialyl Lewisx和P-選擇素單抗與脂質(zhì)微泡外殼的有效連接,成功構(gòu)建攜Sialyl Lewisx和P-選擇素單抗的雙配體靶向超聲微泡和同型對(duì)照單配體靶向超聲微泡。
　　 2、MBS、MBP和MBD在體外均能