靶向P-選擇素載基因和穿膜肽超聲造影劑的制備及實驗研究.pdf

1、第一部分：靶向P-選擇素載基因和穿膜肽超聲造影劑的制備及特性研究
　　目的：制備靶向P-選擇素的載基因和穿膜肽超聲造影劑，并進(jìn)行特性研究。
　　方法：以帶羧基的磷脂為成膜材料，采用機(jī)械振動法制備包載基因和穿膜肽的超聲造影劑，再通過碳二亞胺共價連接法與P-選擇素抗體連接制備靶向P-選擇素的載基因和穿膜肽超聲造影劑。檢測該靶向超聲造影劑的一般物理特性；瓊脂糖凝膠電泳檢測載基因和穿膜肽超聲造影劑對DNA的結(jié)合力和保護(hù)作用；采用激光

2、共聚焦顯微鏡觀察基因和穿膜肽在超聲造影劑中的分布情況；熒光分光光度法檢測超聲造影劑中基因和穿膜肽的包封率；通過免疫熒光法驗證造影劑與抗體的連接情況。
　　結(jié)果：制備的靶向P-選擇素載基因和穿膜肽超聲造影劑的平均粒徑約為(2.15±0.36)μm。光鏡下觀察其形態(tài)規(guī)則，呈圓球形，大小分布均勻，無明顯粘連聚集現(xiàn)象，外觀與非靶向組超聲造影劑比較無明顯差異。瓊脂糖凝膠電泳顯示載基因和穿膜肽超聲造影劑與DNA有較強(qiáng)的結(jié)合力，并能保護(hù)其不被核

3、酸酶水解。激光共聚焦顯微鏡下觀察，基因和穿膜肽均分布在超聲造影劑的外殼上。超聲造影劑中基因和穿膜肽的包封率分別為28％和25％。通過免疫熒光法在倒置熒光顯微鏡下觀察到靶向超聲造影劑外殼呈現(xiàn)紅色熒光。
　　結(jié)論：成功制備了靶向P-選擇素的載基因和穿膜肽超聲造影劑。
　　第二部分：靶向P-選擇素載基因和穿膜肽超聲造影劑促基因轉(zhuǎn)染初步實驗研究
　　目的：探討靶向P-選擇素的載基因和穿膜肽超聲造影劑促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染缺氧損傷型人臍靜

4、脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的可行性。
　　方法：采用過氧化氫誘導(dǎo)HUVEC表達(dá)P-選擇素制備細(xì)胞缺氧損傷模型。光鏡下觀察制備的靶向P-選擇素載基因和穿膜肽超聲造影劑與缺氧損傷的HUVEC的特異性結(jié)合情況，流式細(xì)胞儀檢測特異性結(jié)合率。將缺氧HUVEC隨機(jī)分為靶向載基因和穿膜肽超聲造影劑組和非靶向載基因和穿膜肽超聲造影劑組進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染24h后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在HUVEC中的表達(dá)情況，并采用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率。

5、r>　　結(jié)果：體外特異性結(jié)合實驗顯示，光鏡下靶向超聲造影劑組見造影劑結(jié)合在缺氧損傷的HUVEC周圍，而非靶向超聲造影劑組僅見極少量造影劑與細(xì)胞結(jié)合。流式細(xì)胞儀檢測靶向超聲造影劑組大約有73.80％的細(xì)胞表面結(jié)合有造影劑，而非靶向超聲造影劑組僅有1.39％的細(xì)胞表面結(jié)合有造影劑。轉(zhuǎn)染24h后，倒置熒光顯微鏡下觀察到靶向組和非靶向組均有綠色熒光蛋白在HUVEC中表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示靶向組的轉(zhuǎn)染率高于非靶向組[(18.74±0.47)