靶向納米脂質(zhì)超聲造影劑評價肝臟儲備功能的實驗研究.pdf

1、肝臟是人體新陳代謝的重要器官。目前,肝臟疾病嚴重危害著人們的健康。肝臟具有很大的代償能力,早期肝損傷臨床表現(xiàn)常不明顯。但是,一旦肝臟功能損害嚴重時常常危及人們的生命。因此,尋求一種能無創(chuàng)監(jiān)測肝臟功能的醫(yī)學手段迫在眉睫。
　　 ASGPR是肝實質(zhì)細胞膜上的特異性受體,其能與末端帶半乳糖基的物質(zhì)發(fā)生受體-配體反應,且ASGPR的表達量與肝臟功能密切相關,研究表明,當肝臟功能下降時,ASGPR的含量也相應的減少。國內(nèi)外學者利用其這一特

2、性,對ASGPR介導的載基因或藥物進行了重點研究,取得了巨大的進展。近年來,隨著醫(yī)學分子影像學的飛速發(fā)展,影像學專家也積極的寄希望于利用影像學技術及ASGPR的這一特性,對肝臟功能的儲備進行評估,這不僅對罹患肝臟疾病擬行手術的患者風險估計有重要意義,且對術后病人的恢復情況也能及時、便捷的掌握。隨著超聲造影劑的不斷發(fā)展和超聲分子成像的不斷推進,我們期望能通過制備肝靶向性超聲造影劑,利用超聲特有的無創(chuàng)性這一優(yōu)勢,對肝臟儲備功能進行在體實時的

3、監(jiān)測。以往超聲對于肝功能的檢測方面,常用的包括利用超聲造影來評價肝臟血流的區(qū)域灌注,用多普勒技術檢測超聲促發(fā)造影劑使微泡破裂后血管內(nèi)的動力學改變,研究了血流動力學參數(shù)與肝臟功能的關系。國外也有學者利用超聲多普勒技術,分析肝靜脈與門靜脈的血流多普勒波形對肝臟功能進行評估。而利用ASGPR受體所介導的肝靶向超聲顯像,國內(nèi)外研究甚少。
　　 因此,本課題主要從以下三個部分進行了研究:
　　 第一部分中,我們首先制備了靶向肝細胞

4、膜受體ASGPR的配體一半乳糖化多聚賴氨酸,在此基礎上分別制備了靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑和液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑,驗證了兩種靶向超聲造影劑的體外尋靶能力。
　　 第二部分中,我們研究自制靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑在正常大鼠肝臟靶向性聚集超聲顯影特性,同時,建立不同程度的大鼠肝損傷模型,利用靶向超聲分子顯像對比分析各級別大鼠急性肝損傷后峰值回聲強度的改變與各級別大鼠急性肝損傷后ASGPR的含量及血清學檢查的關系。
　　

5、 第三部分中,為了進一步探索該靶向納米脂質(zhì)超聲造影劑在肝腫瘤領域中的應用,我們研究了普通脂質(zhì)微泡超聲造影劑與自制靶向納米脂質(zhì)超聲造影劑在兔VX2腫瘤模型中的對比顯影特點。
　　 第一部分靶向脂質(zhì)超聲造影劑的制備及體外實驗
　　 目的:(1)采用還原胺化法,人工合成去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的配體半乳糖化多聚賴氨酸(GaL-PLL);探討連接以半乳糖化多聚賴氨酸作為配體的脂質(zhì)微泡超聲造影劑與人肝癌細胞HepG2的靶

6、向結(jié)合能力。(2)探討制備出的肝靶向性液態(tài)氟碳納米超聲造影劑的一般特性、與人肝細胞L02的靶向結(jié)合及體外聚集顯像效果。
　　 方法:(1)用還原胺化法將多聚賴氨酸進行半乳糖化,制備出去唾液酸糖蛋白受體的靶向配體-半乳糖化多聚賴氨酸。SDS-PAGE蛋白電泳鑒別半乳糖化多聚賴氨酸合成情況,計算出所連接的半乳糖與多聚賴氨酸的量的比例。用葡聚糖凝膠柱G-15分離純化并收集半乳糖化多聚賴氨酸。在室溫下與自制脂質(zhì)微泡發(fā)生化學結(jié)合制備成靶向

7、脂質(zhì)微泡,于熒光顯微鏡及激光共聚焦下觀察體外靶向效果。(2)利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及聲振法制備液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑;培養(yǎng)人肝細胞L02,于不同時間點觀察與L02細胞的靶向結(jié)合;飛利浦iU22超聲診斷儀L12-5探頭對比觀察靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑的體外顯像效果。
　　 結(jié)果:(1)半乳糖與多聚賴氨酸在摩爾比為1:100,室溫下反應24h時,能進行高效連接。靶向脂質(zhì)微泡粒徑平均約為2.05μm,大小較均一;激光共聚焦見HepG2

8、肝癌細胞能與靶向造影劑特異性結(jié)合。(2)靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑粒徑極小,分布均勻,形態(tài)呈圓球形,且能與L02有效結(jié)合;體外乳膠囊顯示:脫氣水側(cè)呈現(xiàn)無回聲,靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑側(cè)呈現(xiàn)高回聲。
　　 結(jié)論:(1)連接有以半乳糖化多聚賴氨酸為靶向配體的脂質(zhì)微泡在HepG2肝癌細胞的內(nèi)吞作用下能與之有效結(jié)合。(2)以去唾液酸糖蛋白受體為靶向受體,自制的攜半乳糖化多聚賴氨酸的靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑能有效與人肝細胞

9、L02靶向結(jié)合,該靶向超聲造影劑能在體外聚集顯影。該靶向超聲造影劑粒徑極小,是細胞水平上肝靶向性超聲分子顯像的一種理想的超聲分子探針。
　　 第二部分靶向超聲造影評價大鼠不同程度肝損傷后的肝臟儲備功能
　　 目的:(1)研究自制靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑在正常大鼠肝臟靶向性聚集超聲顯影特性,為超聲分子成像定量評價肝臟功能提供實驗依據(jù)。(2)靶向超聲分子顯像對比分析各級別大鼠急性肝損傷后峰值回聲強度的改變與各級別大鼠急

10、性肝損傷后ASGPR的含量及血清學檢查的關系。
　　 方法:(1)建立大鼠肝功能檢測指標(總蛋白、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶)的標準。健康雄性SD大鼠10只,抽血前一天禁飼,10ml空針分別抽取下腔靜脈血2ml置于離心管中,標記并置于4℃冰箱過夜,待其血清成分自然析出后送檢。
　　 健康雄性SD大鼠10只,經(jīng)尾靜脈團注靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑,注射開始至0.5h內(nèi)連續(xù)觀察并記錄;0.5h至1h內(nèi)每10min觀察

11、并記錄;1h至造影劑消退每30min觀察并記錄肝實質(zhì)超聲圖像。DFY型超聲圖像定量分析診斷儀對各時間點采集到的超聲圖像進行分析。
　　 (2)25只健康雄性SD大鼠隨機分為5組,根據(jù)腹腔灌注四氯化碳(CCl4)分析純的劑量不同,用食用植物油分別配制濃度為10％、20%、30%、40%及50%的CCl4溶液,每組對應注射1ml的配制溶液,1d后10ml空針分別抽取下腔靜脈血2ml置于離心管中,標記并置于4℃冰箱過夜,待其血清成分自

12、然析出后送檢總蛋白、白蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量。確定注射劑量后,按相同的方法建模20只,每組4只,1d后取肝組織分別檢測各組中ASGPR的含量,并取肝組織進行掃描電鏡觀察肝血竇內(nèi)皮細胞間隙即“窗孔”的改變,TUNEL法檢測肝實質(zhì)細胞的凋亡情況。
　　 健康雄性SD大鼠25只,隨機分成5組,每組5只,按前述方法建立不同級別的急性大鼠肝損傷模型,實驗時常規(guī)麻醉,胸腹部備皮,經(jīng)尾靜脈團注靶向液態(tài)氟碳納米脂質(zhì)超聲造影劑,注射開

13、始至0.5h內(nèi)連續(xù)觀察并記錄;0.5h至1h內(nèi)每10min觀察并記錄;1h至造影劑消退每30min觀察并記錄肝實質(zhì)超聲圖像。DFY型超聲圖像定量分析診斷儀對各時間點采集到的超聲圖像進行分析。
　　 結(jié)果:(1)正常大鼠血清總蛋白含量為60.0～80.0g/L,白蛋白含量為30.0～50.0g/L,谷草轉(zhuǎn)氨酶含量為0～200U/L,谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量為0～50 U/L,自制靶向液態(tài)氟碳納米超聲造影劑在正常大鼠肝實質(zhì)的達峰時間為61.2

14、0±4.83min,峰值回聲強度為88.20±0.08dB,靶向造影劑消退較緩慢,清除時間為310.00±17.80min。(2)電鏡觀察到急性肝損傷后肝血竇內(nèi)皮細胞間隙增大;TUNEL染色發(fā)現(xiàn),隨著對實驗大鼠注射CCl4的濃度的增加,肝實質(zhì)細胞凋亡率增加,各組兩兩對照,差異均具有統(tǒng)計學意義;隨著肝損傷程度的增加,肝組織內(nèi)的ASGPR含量逐漸減少,且各組樣本均數(shù)兩兩比較行方差分析,各組樣本均數(shù)差異均P＜0.05;隨著肝損傷程度的增加,肝

15、靶向超聲造影后峰值回聲強度逐漸降低,除正常對照組與10%濃度CCl4組P＞0.05外,其余各組兩兩比較均P＜0.05,而達峰時間、清退時間、造影前肝實質(zhì)回聲強度、清退后肝實質(zhì)回聲強度均P＞0.05;血清學檢查各組總蛋白和白蛋白含量無明顯變化,谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶隨著肝損傷程度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。
　　 結(jié)論:自制的靶向肝實質(zhì)細胞膜受體ASGPR的液態(tài)氟碳納米超聲造影劑的肝靶向性顯影效果佳;不同程度肝損傷后的靶向超聲顯

16、影結(jié)果改變與ASGPR結(jié)果改變一致,有利于超聲顯影定量評價肝臟功能。
　　 第三部分自制靶向脂質(zhì)超聲造影劑與普通脂質(zhì)微泡超聲顯影的對比實驗
　　 目的:探討自制的靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑在正常兔肝臟與VX2兔腫瘤模型的超聲成像特點,對比研究其與普通脂質(zhì)微泡超聲造影劑超聲成像的異同。
　　 方法:制備靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑與普通脂質(zhì)微泡超聲造影劑,分別從正常兔及VX2腫瘤兔耳緣靜脈團注,使用飛利浦iU22超聲診斷儀的

17、造影模式,實時監(jiān)控兩種不同造影劑各自的超聲顯影特點,DFY超聲圖像定量分析診斷儀分析圖像的達峰時間、峰值回聲強度、清除時間并對各組參數(shù)進行比較。
　　 結(jié)果:在正常兔肝實質(zhì),普通脂質(zhì)微泡超聲造影劑(MB)達峰時間明顯早于自制的靶向脂質(zhì)微泡超聲造影劑(MB')達峰時間,峰值回聲強度前者高于后者,清除時間前者顯著短于后者。在VX2腫瘤區(qū),MB達峰時間明顯早于MB',峰值回聲強度前者明顯高于后者,清除時間前者顯著短于后者。