以KDR為靶點的靶向脂質(zhì)體超聲造影劑的制備及體外靶向?qū)嶒炑芯?pdf

1、目的： 以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體KDR為靶點，借助生物素-親和素的橋連及信號放大作用，將與KDR有高度結(jié)合活性的小肽K237與脂質(zhì)體微泡偶聯(lián)，構(gòu)建靶向微泡（MBK237），鑒定其理化特性及生物活性，觀察靶向微泡對腫瘤新生血管特異性顯像作用，以期建立一種新型的腫瘤早期診斷超聲分子成像技術(shù)。 方法: 一、靶向微泡MBK237的制備。 （一）生物素化脂質(zhì)體微泡（MBB）的制備; 1.二棕櫚酰磷脂酰膽

2、堿（DPPC），聚乙二醇（PEG），生物素化脂質(zhì)（DSPE-PEG2000-Biotin）等脂質(zhì)材料按一定比例溶解于適量蒸餾水中，同時通全氟丙烷（C3F8）氣體，聲振至形成乳白色液體，4℃冰箱內(nèi)靜置分層，棄下清，注入相等體積的純水以純化微泡，反復(fù)純化2次，去除游離脂質(zhì)體。 2.取微泡溶液以1：10000比例稀釋，庫爾特顆粒粒度分析儀（MutisizerⅡ，USA）測定微球粒徑、微球濃度、粒徑分布。 （二）制備生物素-親和

3、素橋介導(dǎo)的攜與KDR有高親和力的小肽的靶向脂質(zhì)體微泡（MBK237）; 1.杭州中肽公司合成熒光標(biāo)記的生物素化十二肽（FITC-Biotin-K237），分子量為2523.6 D，氨基酸序列為fitc-C6-His-Thr-Met-Tyr-His-His-His-Gln-His-His-Leu-Lys（Biotin）。短肽K237是Lei Hetian等人從噬菌體展示肽庫分離的一種新的多肽。篩選方法是：以KDR為靶分子，利用親和

4、技術(shù)篩選噬菌體肽庫，通過不斷降低靶分子的濃度、提高洗滌液的強度和競爭性洗脫法，來獲得結(jié)合力強的噬菌體克隆。從第2輪篩選的結(jié)果中，隨機挑選了40個噬菌體克隆擴增，采用ELISA法鑒定它們與KDR的結(jié)合活性，挑選與KDR親和力最高的噬菌體克隆測序，依據(jù)測序結(jié)果化學(xué)制備小肽分子。 2.靶向微泡MBK237的制備： ①親和素-生物素-微泡（Av-MBB）的制備及檢測： MBB靜置純化后搖勻使成為乳白色混懸液，以0.3m

5、l混懸液（約108個泡）為一個樣本，取5組，每組3個樣本，每組樣本分別加入0μg，2μg、6μg、10μg、30μg熒光標(biāo)記親和素（FITC-avidin）構(gòu)建親和素-生物素化微泡（Av-MBB），孵育30min后靜置純化2次，流式細(xì)胞術(shù)檢測微泡的親和素攜帶率，評價出最佳適配劑量。 在普通微泡MB和Av-MBB中分別加入等量FITC標(biāo)記親和素孵育30min充分洗滌后，熒光顯微鏡下觀察兩種微泡的熒光效果。 ②.靶向微泡的制

6、備及檢測： 在MBB混懸液中按108/ml個微泡加入6μg無熒光標(biāo)記avidin，孵育30min，靜置純化2次，搖勻，以0.3ml混懸液為一個樣本，取7組，每組3個樣本，每組分別加入0μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、100μg的FITC-Biontin-k237構(gòu)建靶向微泡MBK237，流式細(xì)胞儀檢測微泡的小肽攜帶率，評價出最佳適配適劑量。庫爾特儀觀察MBK237的物理性狀。光鏡和熒光顯微鏡下觀察靶向微泡

7、大體外觀。 二、靶向微泡MBK237的體外性能鑒定。 （一）細(xì)胞培養(yǎng)及免疫組化染色; 1.人大腸癌LOVO細(xì)胞，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVE）和人結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞，取對數(shù)生長期，0.25％胰酶消化，接種于6孔板中玻片上（3×105/孔），加含10％新生牛血清的1640全培液，5％CO2培養(yǎng)箱孵育，直至細(xì)胞80％飽和。 2.PBS洗滌3次，4％多聚甲醛固定，行常規(guī)KDR免疫組化染色。 （二）體外

8、靶向?qū)嶒? 1.體外結(jié)合實驗： ①將三種細(xì)胞（KDR陽性表達強陽性的LOVO細(xì)胞、陽性的HUVE細(xì)胞、及KDR表達陰性的LS174T細(xì)胞）分別與靶向微泡孵育30min，洗滌后光鏡下和熒光顯微鏡下觀察MBK237與三種細(xì)胞的結(jié)合效果。 ②將三種微泡（靶向微泡，單純K237修飾的脂質(zhì)體微泡，空白微泡）分別與KDR表達強陽性的LOVO細(xì)胞孵育30min，洗滌后光鏡下和熒光顯微鏡下觀察三種微泡與LOVO細(xì)胞的結(jié)合效果。

9、 2.阻斷實驗：分別用10μg、50μg的K237與LOVO細(xì)胞孵育1h，后將處理過的LOVO細(xì)胞與MBK237孵育30min，洗滌后光鏡下觀察MBK237與LOVO細(xì)胞的結(jié)合效果。 3.以Mav=6μg，Mk237=（50μg、70μg、90μg、100μg）的劑量方案制備四種MBK237，分別與LOVO細(xì)胞孵育30min，洗滌后光鏡下觀察不同MBK237與LOVO細(xì)胞的結(jié)合效果。 三、結(jié)果判定: 1.免

10、疫組化結(jié)果判定： 以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)。采用半定量積分法判定結(jié)果[9]，陽性細(xì)胞數(shù)<5％為0分，6％-25％為1分，26％-50％為2分，51％-75％為3分，>75％為4分；無特異性染色為0分，染色強度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，兩者積分相乘，0-1分為陰性（-），2-4分為陽性（+），5以上分為強陽性（++）。 2.花環(huán)形成率計算： 取10個隨機視野的細(xì)胞總數(shù)，每個細(xì)胞

11、結(jié)合5個或以上的微泡視為花環(huán)形成陽性，計算花環(huán)形成率。 四、統(tǒng)計學(xué)處理: 采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析，實驗的計數(shù)資料用百分率表示，計數(shù)資料比較采用Kruskal-Wills H非參數(shù)秩和檢驗，并Games-Howell檢驗法進行多重比較，以P<0.05為有顯著性差異。 五、結(jié)果: （一）三步法制備靶向微泡; 1.生物素化脂質(zhì)體造影劑（MBB）：MBB外觀呈乳白色，微泡濃度約（2～6.3

12、）×109/mL，平均直徑為（2.0～8.3）μm。直徑<5μm的微泡不低于94.6％。在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，可見微泡徑分布均勻，無聚集現(xiàn)象，單個微泡外觀圓整。MBB具有一定的穩(wěn)定性，4℃冰箱密閉放置，可存放一個月以上，并且保持微泡形態(tài)及濃度基本不變。 2.親和素-生物素-微泡（Av-MBB）： 3.攜與KDR有高親和活性肽K237的靶向微泡（MBK237）的制備： ①靶向微泡物理性質(zhì)：MBK237外觀呈乳

13、白色靶向，微泡濃度約（3～8.4）×108/mL，平均直徑為（2.6～8.0）μm。直徑<5μm的微泡不低于90.3％。在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，可見微泡徑分布均勻，無聚集現(xiàn)象，單個微泡外觀圓整。熒光顯微鏡下，靶向微泡外殼激發(fā)出明亮的綠色熒光。 ②靶向微泡的小肽結(jié)合率結(jié)果：MAV=6μg、Mk237=（0μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、70μg、100μg））/108個微泡的劑量比例下，各組微泡的小肽連

14、接率有統(tǒng)計學(xué)差異（X2=18.113，v=6，P=0.006<0.05），認(rèn)為整體而言7組間有顯著性差異；進一步多重比較，連接率較高的第6、7、8組之間兩兩比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），認(rèn)為當(dāng)Mk237≥50μg時連接曲線進入平臺期。加入KDR高親和力小肽MK237=50μg，可使83.4600％±1.58218％的微泡表面帶有熒光信號。 （二）體外鑒定結(jié)果; 1.細(xì)胞培養(yǎng); LOVO細(xì)胞生長旺盛，形態(tài)良

15、好，典型呈梭形，兩端尖細(xì)，胞質(zhì)均勻透明，隨時間延長變化不大。HUVECs接種2h后可見貼壁，24h后完全貼壁，細(xì)胞均呈短梭形或多角形，排列緊密，似鵝卵石或“鋪路石”樣，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的典型形態(tài)。LS174T細(xì)胞24h完全貼壁，細(xì)胞呈梭形或多邊形，呈“團簇狀”不均勻分布是該細(xì)胞的典型特征。 2.免疫組化染色; LOVO細(xì)胞KDR呈強陽性表達，HUVEC呈陽性表達，陽性物質(zhì)均定位于細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)；LS174T細(xì)胞KDR呈陰

16、性表達。 3.靶向造影劑的體外鑒定： （1）體外結(jié)合實驗： ①光鏡下LOVO細(xì)胞周圍可見MBK237圍繞細(xì)胞或黏附于細(xì)胞之上，形成類似花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，花環(huán)形成率平均為90.52％，熒光鏡下微泡外殼發(fā)出明亮的綠色熒光；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）周圍可見MBK237形成的花環(huán)結(jié)構(gòu)，花環(huán)形成率平均為53.46％，熒光顯微鏡下微泡外殼發(fā)出綠色熒光；對照組LS174T細(xì)胞周圍可見少許幾個微泡黏附，花環(huán)形成率為5.57％，熒

17、光顯微鏡下微泡外殼可見熒光。 ②MBK237與靶細(xì)胞LOVO結(jié)合，花環(huán)形成率為87.62％，熒光顯微鏡下微泡外殼發(fā)出明亮的綠色熒光；小肽-微泡復(fù)合物（K237-MBB）與LOVO細(xì)胞孵育，花環(huán)形成率為1.43％，相對靶向微泡組顯著減少，熒光顯微鏡下可見微泡外殼發(fā)出熒光；表面無修飾的空白微泡（MB）與LOVO細(xì)胞孵育，僅見幾個微泡散在黏附于LOVO細(xì)胞周圍，但黏附數(shù)目<5，花環(huán)實驗陰性，熒光顯微鏡下黏附的幾個微泡外殼無熒光。