血栓靶向超聲造影劑的制備與特異性增強血栓顯像的實驗研究.pdf

1、背景 近15年來，超聲造影劑(Ultrasoundcontrastagent，UCA)的應(yīng)用得到迅速發(fā)展，從早期的血池顯像增強，到對淋巴、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的被動靶向作用以及近年來對表達(dá)在血管內(nèi)皮、動脈粥樣硬化、炎癥、血栓部位特定因子的主動靶向作用，拓寬了超聲在臨床或?qū)嶒炑芯恐械膽?yīng)用范圍。靶向超聲成像是將先進(jìn)的超聲成像技術(shù)與先進(jìn)的生物化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，在微泡的外殼連接針對組織特異受體的配體或針對特異抗原的抗體，致使攜帶有某種生物學(xué)活性

2、分子的超聲造影劑微泡具有與特定組織粘附的趨向性，經(jīng)靜脈注射后，含氣體的靶向微泡到達(dá)某種感興趣的特定區(qū)域，通過在靶部位的高濃度聚集而達(dá)到增強靶區(qū)的超聲顯像效果，達(dá)到對疾病進(jìn)行無創(chuàng)性評價的目的。靶向超聲微泡與普通微泡一樣，大都為內(nèi)含氣體的微氣泡，其外殼的成分可為人血白蛋白、脂類物質(zhì)、棕櫚酸和聚合物等。靶向超聲造影劑的應(yīng)用非常廣泛，但目前大多數(shù)靶向超聲造影劑尚處于實驗研究的初始階段，其發(fā)展還有許多問題有待解決。 血栓形成和栓塞是臨床上

3、常見的一種疾病，導(dǎo)致一系列并發(fā)癥。早期準(zhǔn)確地檢出血栓并加以治療，對于降低死亡率及并發(fā)癥的發(fā)生率非常重要。超聲是一種被廣泛應(yīng)用于臨床的影像檢測手段，對四肢靜脈血栓的診斷與隨訪觀察具有重要的意義，但對于盆腔深靜脈、下腔靜脈血栓的檢出準(zhǔn)確率受到限制，則有賴于創(chuàng)傷性深靜脈造影或昂貴的MRI檢測。另外，超聲對鑒別新鮮血栓與陳舊性血栓也有一定的難度。如果能制備一種血栓特異性靶向超聲造影劑，以此改善血栓的超聲顯影效果，進(jìn)而有望提高超聲檢出血栓的準(zhǔn)確性

4、和敏感性。在美國和歐洲，左心及腹部超聲造影劑已經(jīng)商品化，有關(guān)血栓特異性靶向超聲造影劑的制備與體外實驗研究已見一些報道，但體內(nèi)實驗研究報道少見，國內(nèi)則未見相關(guān)報道。 目的 制備血栓特異靶向性白蛋白氟烷超聲造影劑，評價該血栓靶向超聲造影劑微泡與配體的結(jié)合率，探討其體內(nèi)外與靶結(jié)合的能力及尋靶的特點和規(guī)律，通過目測及視頻強度定量分析法評價該靶向超聲造影劑增強兔腹主動脈新鮮血栓顯像的效果。 方法 一、血栓靶向白蛋白

5、氟烷超聲造影劑的制備與鑒定 在成功制備普通白蛋白氟烷超聲造影劑的前期實驗基礎(chǔ)上，采用戊二醛交連法將帶有熒光標(biāo)記的能與血小板糖蛋白(GP)ⅡB/ⅢA受體特異結(jié)合的6-肽(FITC-KV-6)與普通白蛋白氟烷微泡結(jié)合，制各攜6-肽的血栓靶向白蛋白氟烷超聲微泡。經(jīng)普通顯微鏡觀測靶向微泡的粒徑與分布情況；采用血細(xì)胞計數(shù)儀檢測靶向微泡的濃度；經(jīng)熒光顯微鏡觀測6肽與靶向微泡外殼的結(jié)合情況；流式細(xì)胞儀評價6肽與靶向微泡的結(jié)合率及相關(guān)影響因素。

6、 二、體外尋靶實驗 各取2ml人肘靜脈及兔耳緣靜脈新鮮血，制成新鮮血凝塊，將帶有FITC-KV-6的靶向白蛋白氟烷微泡混懸液滴加于新鮮血凝塊上，靜置30min；普通白蛋白氟烷微泡混懸液滴加于新鮮血凝塊上作為對照組1；6-肽阻斷實驗作為對照組2。用生理鹽水將三組載玻片輕柔沖洗后，分別在普通光鏡與熒光顯微鏡下觀察微泡與血凝塊的結(jié)合情況。 三、兔腹主動脈非梗阻性血栓模型的建立 分別采取三氯化鐵(FeCl3)化學(xué)

7、腐蝕、注入凝血酶、動脈鉗夾+擠壓三種方法誘發(fā)血栓形成，獲取模型建立前及模型建立后各時間段實驗段血管的超聲圖像(二維+彩色多普勒)并儲存。將19只實驗兔隨機分為三組：A組：三氯化鐵(FeCl3)誘發(fā)組9只，根據(jù)浸潤時間另分為3小組：30min(A1組)、50min(A2組)、80min(A3組)三個時間段各3只。B組：注入凝血酶組5只。C組：動脈鉗夾+擠壓組5只。 四、靶向造影劑體內(nèi)增強血栓顯像實驗 模型建立：新西蘭大白兔

8、33只，游離腎動脈平面以上腹主動脈約1cm。采用70％的FeCl3溶液浸潤50min，誘發(fā)兔腹主動脈非梗阻性血栓形成，獲取模型建立前后實驗段血管的超聲圖像并儲存。超聲造影：靶向造影組，經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注0.04ml/kg靶向白蛋白氟烷超聲造影劑，連續(xù)觀察10min；普通造影+靶向造影，首先經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注0.04ml/kg的普通白蛋白氟烷超聲造影劑，連續(xù)觀察10分鐘，間隔40min后經(jīng)CDFI爆破殘留的微泡后再團(tuán)注0.04ml/kg靶向白蛋白

9、氟烷超聲造影劑，連續(xù)觀察10min；普通造影組，經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注0.04ml/kg的普通白蛋白氟烷微泡，連續(xù)觀察10min。造影前后適時動態(tài)圖像儲存。標(biāo)本處理：將標(biāo)本冷凍切片后作熒光檢測，觀察微泡在血栓內(nèi)的分布情況，并取標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、HE染色作病理檢測。造影效果評價：分別進(jìn)行目測評價與視頻灰階定量評價，進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 一、血栓靶向白蛋白氟烷超聲造影劑的制備與鑒定 靶向白蛋白

10、氟烷微泡平均粒徑為2～6μm，配制濃度約6×109/ml，生理鹽水稀釋后仍呈均勻分散的微氣泡。與普通白蛋白氟烷微泡相比，靶向白蛋白氟烷微泡間略有聚集現(xiàn)象。熒光顯微鏡下觀察，可見靶向白蛋白氟烷微泡殼發(fā)出明亮的熒光；而對照組普通白蛋白氟烷微泡未見熒光發(fā)出。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，血栓靶向白蛋白氟烷微泡與配體的最高結(jié)合率為80.25％，普通白蛋白氟烷微泡對照值為0.62％；血栓靶向白蛋白氟烷微泡的稀釋濃度對配體結(jié)合率的影響不顯著(P＞0.05

11、)；漂洗游離配體時，離心時間與離心速度對配體結(jié)合率的影響非常顯著(P＜0.01)。 二、血栓靶向白蛋白氟烷超聲造影劑體外尋靶實驗 靶向白蛋白氟烷微泡組：普通光鏡及熒光顯微鏡下均可見白蛋白靶向氟烷微泡在人或兔血凝塊外圍形成一條高濃度聚集帶，寬約0.1～0.3mm，并順著網(wǎng)格狀的纖維素帶延伸到血塊內(nèi)部；普通白蛋白氟烷微泡對照組：在血凝塊外圍僅見零星的普通白蛋白氟烷微泡分布，未見微泡與血凝塊的特異性結(jié)合；6肽阻斷對照組：在血凝

12、塊外圍僅見零星的靶向白蛋白微泡，未見靶向白蛋白微泡與血凝塊的特異性結(jié)合。 三、動物模型的建立 A組9只及B組5只實驗兔均成功建立腹主動脈血栓模型，其中，A3組和B組均為梗阻閉塞性血栓，A1組和A2組為非梗阻性血栓。C組股動脈梗阻性血栓模型成功建立，但實驗段腹主動脈未見血栓形成。病理結(jié)構(gòu)評價：FeCl3誘發(fā)組為混合型血栓，血栓結(jié)構(gòu)致密；注入凝血酶組血栓結(jié)構(gòu)松散；動脈鉗夾+擠壓組為紅色血栓，血栓結(jié)構(gòu)較緊密。 四、血栓

13、靶向白蛋白超聲造影劑體內(nèi)增強血栓顯像實驗 1.造影增強目測評價：32只兔成功建立非梗阻性血栓模型，1只兔因?qū)嶒炦^程中主動脈破裂大出血死亡。靶向白蛋白造影劑推注后約8s在腹主動脈腔內(nèi)顯影，30s時兔腹主動脈附壁血栓回聲顯增強，與血管腔的界限可辨，呈弧形增強光帶；240s時血管腔內(nèi)造影劑消失，18只兔腹主動脈內(nèi)模型血栓顯影明顯增強，連續(xù)觀察10min，血栓回聲仍明顯增強；1只兔腹主動脈附壁血栓顯影輕度增強。普通白蛋白造影劑對血栓的目

14、測增強效果不明顯，只有2只有輕度的增強。兩組比較相差非常顯著(P＜0.01)。 2.造影增強視頻定量分析：模型制作前血管腔平均灰階值5.301±0.49；模型制作后造影前(0s)附壁血栓平均灰階值18.741±2.86，與模型制作前比較相差顯著(P＜0.05)。團(tuán)注靶向白蛋白造影劑后于240s時附壁血栓灰階值達(dá)到峰值(平均灰階值為98.463±6.3，與造影前0s比較相差非常顯著，P＜0.001)，后緩慢下降，連續(xù)觀察至600s

15、時血栓平均灰階值為55.75±3.99，仍明顯高于造影前0s(P＜0.001)。團(tuán)注普通白蛋白造影劑造影后于180s達(dá)到峰值(平均灰階值為32.4±3.5，與造影前0s及靶向造影組平均灰階峰值比較相差均非常顯著，P＜0.001，P＜0.001)，后緩慢下降，至600s時血栓平均灰階值為24.36±3.15，與造影前0s比較相差顯著(P＜0.05)，與靶向造影組600s時平均灰階值比較相差非常顯著(P＜0.001)。在普通造影組造影結(jié)束后

16、，間隔40min，用CDFI爆破殘余微泡，有3只實驗兔實驗段血管出現(xiàn)再通，放棄再注射；另10只兔團(tuán)注相同劑量的靶向造影劑后附壁血栓灰階值峰值為98.573±4.2，與造影前0s比較相差非常顯著(P＜0.001)。 3.免疫熒光檢查：將游離血管標(biāo)本冷凍切片后即刻置于熒光顯微鏡下觀察，于靶向造影組腹主動脈附壁血栓內(nèi)可見散在分布的微泡，微泡殼發(fā)出明亮的熒光(部分已破裂)；普通造影對照組僅見血管壁平滑肌發(fā)出綠色熒光，附壁血栓未見熒光顯示

17、，亦未見發(fā)出熒光的微泡；自身對照組腹主動脈附壁血栓內(nèi)亦可見散在分布的熒光微泡。 結(jié)論 1.制備靶向超聲造影劑的關(guān)鍵是將靶向配體連接到微泡外殼上。本研究根據(jù)成膜材料白蛋白及肽類配體的特性，采用戊二醛交連法將血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體-6肽整合于白蛋白微泡外殼上，最高結(jié)合率為80.25％，成功制備出血栓靶向白蛋白氟烷超聲造影劑，方法簡單、成本較低、重復(fù)性好，具有較好的應(yīng)用前景。 2.與普通白蛋白氟烷造影劑相比，血栓靶