超聲輻照載藥有序介孔有機硅超聲造影劑靶向治療腫瘤的實驗研究.pdf

1、第一部分、載藥有序介孔有機硅(HPMOs)造影劑用于高效的超聲影像、超聲輻照的藥物控釋和輔助腫瘤化療
　　第一章:有序介孔有機硅(Hollow periodic mesoporous organosilicas HPMOs)的制備、理化性質(zhì)及藥物負載研究
　　目的:研究HPMOs的制備、理化性質(zhì)及藥物負載。
　　方法:采用“結(jié)構(gòu)差異的選擇性刻蝕法”制備HPMOs納米粒子;納米粒子的形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)由透射電子顯微鏡和掃描透

2、射電子顯微鏡獲得。動態(tài)光散射和N2吸附-解吸等溫線測量HPMOs的粒徑、比表面積、孔容和孔徑;采用UV-vis吸收光譜測定PTX-HPMOs中紫杉醇(paclitaxel PTX)的負載量。
　　結(jié)果:HPMOs具有球形形貌和高分散性，表面光滑;平均粒徑450.2 nm;比表面積:1029.4m2/g、孔容:0.66cm3/g、孔徑:3.8nm; PTX-HPMOs中紫杉醇的載藥量為91 mg/g。
　　結(jié)論:HPMOs具有

3、納米級的粒徑和空心介孔結(jié)構(gòu);具有獨特的藥物封裝特性，藥物負載量高。
　　第二章:HPMOs作為超聲造影劑在體外的超聲成像研究
　　目的:評估HPMOs作為超聲造影劑在體外的顯像效果。
　　方法:方法1，將不同濃度(5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)的HPMOs/PBS溶液(2ml)分別裝入小水囊中，再將小水囊放入大水囊中。觀察其在不同超聲影像模式和不同機械指數(shù)下的顯像效果。方法2，將2ml20mg/ml的H

4、PMOs/PBS溶液和SonoVue分別抽入小注射器中，其針尖插入另一含生理鹽水的大注射器中，實時注入試劑，觀察顯像效果。
　　結(jié)果:HPMOs作為超聲造影劑在諧波（Harmonic-）和對比增強（contrast-）模式下都能獲得良好的超聲增強圖像。并且這種增強顯像具有明顯的濃度和機械指數(shù)(MI)依賴性。
　　結(jié)論:HPMOs作為一種新型納米有機/無機雜化介孔材料，因其內(nèi)部大的空腔結(jié)構(gòu)，可作為超聲造影劑，且穩(wěn)定性高，無需低

5、機械指數(shù)條件，在常規(guī)超聲條件下即可造影成像，在腫瘤化療過程中，可以提供高質(zhì)量的影像以監(jiān)測治療的效果。
　　第三章:超聲輻照PTX-HPMOs體外藥物釋放動力學研究
　　目的:研究超聲體外輻照能否智能控釋HPMOs中負載的化療藥物PTX。
　　方法:將PTX-HPMOs溶于PBS釋放介質(zhì)中，觀察自然條件下PTX-HPMOs藥物釋放規(guī)律;然后在不同的時間點附加超聲輻照，采用UV-vis吸收光譜測定超聲輻照前后釋放介質(zhì)中紫杉

6、醇(PTX)的含量。
　　結(jié)果:超聲輻照后，包封在HPMOs中的抗腫瘤藥PTX出現(xiàn)突釋，每次超聲輻照可以增加18％的紫杉醇釋放量。
　　結(jié)論:超聲輻照可以明顯的增加PTX從載體HPMOs中的釋放量，因而超聲輻照PTX-HPMOs可以作為一種刺激-響應藥物釋放體系，按需智能釋放藥物，從而可以用于腫瘤的靶向化療。
　　第四章:超聲輻照PTX-HPMOs對人宮頸癌Hela細胞作用的實驗研究
　　目的:研究PTX-HPM

7、Os結(jié)合超聲輻照能否增強對人宮頸癌Hela細胞的殺傷力。
　　方法:96孔培養(yǎng)板分成6區(qū)（每區(qū)4個復孔）共3塊培養(yǎng)板，種植Hela細胞，置37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁12小時后，吸出培養(yǎng)板每孔內(nèi)的陳舊培養(yǎng)液，3塊板分別加入不同濃度的裸藥紫杉醇; PTX-HPMOs;第3塊板在加入PTX-HPMOs后室溫下經(jīng)培養(yǎng)板底部分別對每區(qū)細胞進行治療性超聲輻照。輻照完成后繼續(xù)同上條件培養(yǎng)24小時，行CCK-8實驗檢測細胞存活率。

8、
　　結(jié)果:本實驗所采用的超聲輻照條件本身對細胞沒有產(chǎn)生毒性，細胞存活率100％;而不同濃度的裸藥PTX以及PTX包封在HPMOs后對細胞株均產(chǎn)生了一定的毒性;當PTX-HPMOs濃度為5μg/ml時，超聲輻照后有64.44％的Hela細胞在24小時內(nèi)死亡，細胞存活率明顯低于單純采用PTX-HPMOs或裸藥。當PTX-HPMOs濃度進一步增加到10μg/ml時，超聲輻照后細胞存活率進一步降低，超過75.69％的Hela細胞在24小

9、時內(nèi)死亡，明顯低于單純采用PTX-HPMOs或裸藥。
　　結(jié)論:超聲輻照可以有效地提高PTX-HPMOs對腫瘤細胞的殺傷效果。
　　第五章:超聲輻照PTX-HPMOs對裸鼠移植瘤作用的實驗研究
　　目的:評估超聲輻照PTX-HPMOs對裸鼠移植瘤的治療作用。
　　方法:將成功建立裸鼠皮下Hela人宮頸癌細胞移植瘤模型的12只裸鼠隨機分成4組，每組3只。各組的處理方法分別為，對照組腫瘤內(nèi)注入生理鹽水;紫杉醇組腫瘤內(nèi)

10、注入臨床常用藥PTX; PTX-HPMOs組腫瘤內(nèi)注入PTX-HPMOs;PTX-HPMOs+US組與PTX-HPMOs組給藥方法相同，給藥后將超聲治療儀探頭直接輻照腫瘤組織區(qū)域。
　　結(jié)果: PTX-HPMOs+US組腫瘤生長受到明顯的抑制，和對照組相比，差異明顯;治療后PTX-HPMOs+US組腫瘤重量為0.27±0.08g，對照組腫瘤重量為0.69±0.14g，PTX-HPMOs組腫瘤重量為0.49±0.10g，PTX組腫瘤

11、重量為0.44±0.11g，PTX-HPMOs+US組和其余3組相比，瘤重抑瘤率均有明顯的差異。結(jié)論:超聲輻照PTX-HPMOs具有優(yōu)越的抗腫瘤效果。
　　第六章:HPMOs作為超聲造影劑在裸鼠體內(nèi)的超聲成像研究
　　目的:評估HPMOs作為超聲造影劑在裸鼠體內(nèi)的超聲成像效果。
　　方法:將成功建立裸鼠皮下移植瘤模型的9只裸鼠隨機分成3組，每組3只。對照組經(jīng)尾靜脈注入生理鹽水;SonoVue組注入SonoVue: PT

12、X-HPMOs組注入PTX-HPMOs。分別在注入即刻、30s和第7天時觀察腫瘤組織內(nèi)回聲情況。
　　結(jié)果:SonoVue在腫瘤內(nèi)呈快進快出的顯像模式，2分鐘后腫瘤內(nèi)即不能檢出造影劑的存留;PTX-HPMOs在腫瘤組織內(nèi)能快速彌散，彌散均勻，且PTX-HPMOs在腫瘤內(nèi)存留時間長，7天后腫瘤內(nèi)仍然能檢出造影劑的顆粒。
　　結(jié)論:PTX-HPMOs作為超聲造影劑在裸鼠腫瘤組織內(nèi)有良好的超聲顯像效果，穩(wěn)定性好。在腫瘤組織內(nèi)該納米

13、粒子能快速彌散，且彌散均勻。重要的是，PTX-HPMOs在腫瘤內(nèi)存留時間長，能起到緩慢釋藥的效果。
　　綜上所述，超聲輻照載藥超聲造影劑靶向腫瘤化療成為目前一項具有挑戰(zhàn)性的研究——其同時具有藥物攜帶和傳遞、被動靶向腫瘤、超聲藥物控釋、腫瘤超聲實時增強顯像的功能。
　　第二部分、載藥有序介孔有機硅造影劑在HIFU腫瘤綜合診治體系中的應用探索
　　第一章:HPMOs負載抗癌藥物阿霉素(Doxorubicin DOX)的研究

14、
　　目的:評估HPMOs作為藥物載體負載DOX的能力。
　　方法:采用UV-vis吸收光譜測定DOX-HPMOs中阿霉素的負載量。
　　結(jié)果:DOX-HPMOs的載藥量94.2mg/g。
　　結(jié)論:HPMOs的藥物負載量高，這一高的負載量主要歸因于巨大的空腔結(jié)構(gòu)，以及具有較大比表面積/孔容的介孔殼層的雙重貢獻。
　　第二章:HIFU輻照DOX-HPMOs體外藥物釋放動力學研究
　　目的:研究HIFU

15、體外輻照能否智能控釋HPMOs中負載的化療藥物DOX。
　　方法:將DOX-HPMOs溶于PBS釋放介質(zhì)中，配制成濃度為5mg/ml的溶液，吸取4個1ml，分別置于透析袋中，再將透析袋置于50ml PBS釋放介質(zhì)中，并將透析袋置于HIFU的焦點處。采用不同的HIFU能量釋放模式以及不同的功率和時間進行體外釋放考察。在HIFU輻照前后取樣，測量樣品中DOX的含量。
　　結(jié)果:DOX從載體HPMOs中的釋放不受溫度的影響。PW-

16、HIFU(200W/cm260s)輻照DOX-HPMOs1次可以增加15％的DOX釋放量。DOX-HPMOs暴露在PW-HIFU后，樣品局部的溫度輕微上升;200W CW-HIFU輻照DOX-HPMOs4分鐘后，DOX釋放了76.15％，等同于PW-HIFU(200W/cm260s)間隙輻照DOX-HPMOs4次，但局部溫度上升明顯，從37上升到50℃。
　　結(jié)論:PW-HIFU和CW-HIFU均可以有效地控釋DOX，但PW-HI

17、FU避免了CW-HIFU連續(xù)發(fā)射超聲波所致的溫度升高，從而避免了對周圍正常組織的熱損傷，重要的是，溫度的上升并不能促進DOX從載體中的釋放。因此，我們設想DOX-HPMOs的高載藥量，再加上PW-HIFU可以有效地控釋DOX，那么這一新型的納米材料就可以用于HIFU介導的藥物控釋和輔助腫瘤化療。
　　第三章: DOX-HPMOs細胞內(nèi)的攝取研究
　　目的:評估DOX-HPMOs納米粒子能否被腫瘤細胞主動吸收。
　　方法

18、:Hela人宮頸癌細胞接種到共聚焦皿中，在37攝氏度5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄去共聚焦皿中培養(yǎng)液，加入1ml含有50ug/ml的DOX-HPMO的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)2h、6h，在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。對照組加入含藥濃度相同的裸藥阿霉素培養(yǎng)液。每組共聚焦照片分三張，分別是明場像、熒光像和融合像。
　　結(jié)果:DOX-HPMOs和Hela細胞共培養(yǎng)2小時后，共聚焦顯微鏡觀察到DOX的紅色熒光強烈定位在細胞內(nèi)，且熒光強度強于裸藥D

19、OX;6h后，其細胞核中也觀察到了DOX的紅色熒光，而與DOX共培養(yǎng)的Hela細胞，6h后其細胞核中DOX的紅色熒光不明顯。
　　結(jié)論: DOX-HPMOs可以被Hela細胞主動吸收到細胞內(nèi)，保證了HPMOs中所封裝藥物的細胞內(nèi)高輸送效率，可以導致更高的細胞毒性。更為重要的是，該納米粒子被細胞吞噬后不僅能進入細胞質(zhì)，而且能透過核膜進入細胞核。
　　第四章:HPMOs在離體脫氣牛肝組織中的HIFU增效實驗
　　目的:評價

20、HPMOs在離體脫氣牛肝組織中的HIFU增效效果。
　　方法:新鮮脫氣牛肝置入脫氣水囊中。沿HIFU治療頭X軸方向取3個連續(xù)層面。用5ml注射器針頭+1ml注射器吸取試劑(PBS、HPMOs/PBS)，將針頭垂直刺入牛肝中間深度，在超聲監(jiān)視下，迅速注射入0.3ml的各個實驗組試劑，并立即在注射點分別用一定劑量的HIFU進行輻照(100W/cm27s;150W/cm24s)，消融后壞死的牛肝組織可以通過超聲影像灰度的變化實時顯示。輻

21、照結(jié)束后，測量壞死區(qū)域體積。
　　結(jié)果:注入HPMOs后HIFU(150W/cm24s)局部輻照牛肝，灰度值達98±6.87dB，而單純注入PBS溶液，局部HIFU輻照后牛肝灰度值13±1.39dB;牛肝組織局部注入不同的材料，HIFU消融壞死的平均容積分別為:HPMOs/PBS(150W/cm24s28.29mm3;100W/cm27s11.97mm3);PBS(150W/cm24s12.43mm3;100W/cm27s8.58

22、rnm3)。牛肝局部注入HPMOs/PBS后， HIFU(150W/cm24s)消融的容積明顯增大;注入HPMOs/PBS后，HIFU100W/cm27s作用和注入PBS后，HIFU150W/cm24s作用，局部消融的容積相當。
　　結(jié)論:HPMOs/PBS可以作為HIFU治療的增效劑，明顯增強HIFU消融治療的效果，在HIFU低功率的同時達到高效的消融效果，同時避免對周圍正常組織的熱損傷。
　　第五章:HIFU聯(lián)合DOX-

23、HPMOs治療ICR小鼠S-180肉瘤的療效實驗
　　目的:評估HIFU聯(lián)合DOX-HPMOs綜合治療ICR小白鼠S-180肉瘤的療效
　　方法:將建立小白鼠皮下移植瘤模型的20只鼠隨機分成4組，每組5只。(i)單純HIFU組;(ii)單純DOX-HPMOs組;(iii) DOX-HPMOs+HIFU組;(iV)對照組。上述處理方法每組每周1次，連續(xù)2周。每2天測量一次腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線。實驗第15天處死小白鼠，剝離

24、腫瘤。用游標卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)大小，用電子天平測量腫瘤重量，計算瘤重抑瘤率和體積抑瘤率。取腫瘤組織浸泡于多聚甲醛溶液中，送病理科作切片HE染色，光鏡下觀察細胞壞死情況，石蠟切片TUNEL染色觀察細胞凋亡情況。
　　結(jié)果:DOX-HPMOs+HIFU組的體積抑瘤率為80％，而單純HIFU組以及DOX-HPMOs組分別為51.10％和69.22％，DOX-HPMOs+HIFU組與單純HIFU組以及DOX-HPMOs組相比均有明顯差異(P

25、＜0.05）; DOX-HPMOs+HIFU組的瘤重抑瘤率為72.88％，而單純HIFU組以及DOX-HPMOs組分別為34.14％和59.11％，DOX-HPMOs+HIFU組與單純HIFU組以及DOX-HPMOs組相比均有明顯差異（P＜0.05）。TUNEL染色后的組織學觀察以及腫瘤組織光鏡檢查表明:對照組腫瘤細胞生長良好。單純HIFU組和單純DOX-HPMOs組腫瘤組織內(nèi)可見少許壞死組織及相間分布的癌組織。DOX-HPMOs加HI