靶向超聲微泡MBICAM-1的制備及靶向?qū)嶒?yàn)研究.pdf

1、第一部分靶向超聲微泡MBICAM-1的制備及體內(nèi)顯影實(shí)驗(yàn)
　　目的：制備靶向超聲微泡MBICAM-1，鑒定所制備微泡的基本性質(zhì)，并進(jìn)行大鼠肝臟顯影實(shí)驗(yàn)。
　　方法：利用磷脂混懸液制備普通脂質(zhì)微泡MB以及生物素化脂質(zhì)微泡MBbiotin;通過“生物素-親和素”橋接法把抗ICAM-1單抗結(jié)合到生物素化脂質(zhì)微泡MBbiotin表面，制備成靶向超聲微泡MBICAM-1；分別檢測(cè)所制備微泡的濃度及粒徑，并在顯微鏡下觀察微泡的形態(tài)；熒光

2、免疫染色法驗(yàn)證抗ICAM-1單抗與微泡的結(jié)合；流式細(xì)胞儀檢測(cè)微泡與抗ICAM-1單抗的結(jié)合率；將制備的微泡對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行超聲造影(CEUS，contrast-enhanced ultrasonography)對(duì)比分析微泡的顯影效果。
　　結(jié)果：利用磷脂混懸液制備的普通脂質(zhì)微泡MB平均粒徑為1.57μm，濃度為1.0×109/mL；生物素化脂質(zhì)微泡MBbiotin平均粒徑為1.09μm，濃度為2.3×1010/mL；“生物素-親和素

3、”橋接法制備的靶向超聲微泡MBICAM-1平均粒徑為2.28μm，濃度為2.4×108/mL；顯微鏡下可見三種微泡的形態(tài)完整、規(guī)則，分布較均勻；熒光素FITC標(biāo)記的靶向超聲微泡MBICAM-1在熒光顯微鏡下表達(dá)綠色熒光；流式細(xì)胞儀檢測(cè)到微泡和抗ICAM-1單抗的平均結(jié)合率為（86.5±5.3）％；制備的微泡在大鼠肝臟造影中均呈高增強(qiáng)，與聲諾維效果相似。
　　結(jié)論：利用磷脂混懸液成功制備了普通脂質(zhì)微泡MB和生物素化脂質(zhì)微泡MBbio

4、tin；通過“生物素-親和素”橋接法成功制備了靶向超聲微泡MBICAM-1；制備的各種微泡在大鼠肝臟內(nèi)呈高增強(qiáng)，與聲諾維效果相似。
　　第二部分靶向超聲微泡MBICAM-1的靶向?qū)嶒?yàn)研究
　　目的：研究靶向超聲微泡MBICAM-1在體外及體內(nèi)的靶向能力。
　　方法：構(gòu)建ICAM-1質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增、提取后，檢測(cè)提取質(zhì)粒的濃度、進(jìn)行酶切電泳并對(duì)構(gòu)建的ICAM-1質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；體外培養(yǎng)Hela細(xì)胞，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將ICAM

5、-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞，使Hela細(xì)胞表達(dá)ICAM-1表面抗原，熒光顯微鏡下觀察Hela細(xì)胞的ICAM-1表面抗原表達(dá)情況；顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染成功后的Hela細(xì)胞與靶向超聲微泡MBICAM-1的結(jié)合情況。通過對(duì)6只家兔的左側(cè)跟腱注射Ⅰ型膠原酶制造跟腱炎癥模型，右側(cè)跟腱注射等量生理鹽水作為對(duì)照組，每天觀察家兔雙側(cè)跟腱表面有無紅腫以及家兔的行走步態(tài)；10天后超聲觀察家兔雙側(cè)跟腱，并用第一部分制備的三種微泡對(duì)雙側(cè)跟腱進(jìn)行超聲造影檢查，觀察對(duì)

6、比雙側(cè)跟腱超聲造影增強(qiáng)情況；取雙側(cè)跟腱標(biāo)本進(jìn)行蘇木素-伊紅（H-E）染色、免疫組化法觀察雙側(cè)跟腱病理情況。
　　結(jié)果：ICAM-1質(zhì)粒的酶切電泳以及測(cè)序正確，提取到的ICAM-1質(zhì)粒濃度為592.8ng/μL；熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞表達(dá)綠色熒光；顯微鏡下可見到靶向超聲微泡MBICAM-1與轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞結(jié)合，靶向超聲微泡MBICAM-1環(huán)繞在Hela細(xì)胞周圍。家兔造模后，左側(cè)跟腱出現(xiàn)紅腫以及左下肢跛行，右側(cè)跟腱

7、未見明顯異常；造模10天后進(jìn)行超聲檢查，家兔左側(cè)跟腱內(nèi)部回聲不均，左側(cè)跟腱厚約2.23±0.15mm，右側(cè)跟腱回聲尚均勻，右側(cè)跟腱厚度約1.77±0.08mm；超聲造影觀察：普通脂質(zhì)微泡MB、生物素化脂質(zhì)微泡MBbiotin對(duì)家兔雙側(cè)跟腱造影均呈微弱增強(qiáng)，靶向超聲微泡MBICAM-1對(duì)家兔右側(cè)跟腱造影呈微弱增強(qiáng)，對(duì)左側(cè)跟腱造影呈高增強(qiáng)；跟腱病理顯示左側(cè)跟腱新生血管增多，膠原纖維排列疏松、紊亂，左側(cè)跟腱表達(dá)ICAM-1表面抗原細(xì)胞數(shù)目達(dá)3