超聲聯合微泡促HGF修飾BMSCs靶向歸巢抗腎纖維化的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　腎小管間質纖維化是大多數慢性腎病的終末期表現,因此及早控制和逆轉腎臟纖維化的進程是慢性腎臟疾病治療中非常重要的治療途徑。
　　研究表明骨髓間充質干細胞(BMSCs)由于其高可塑,易分化等特性,在組織修復和器官再生的細胞治療和基因治療等領域表現出特有的優(yōu)勢。對于腎臟而言,骨髓干細胞可以分化為腎臟細胞包括系膜細胞、內皮細胞、足細胞和腎小管上皮細胞等,這就使得BMSCs成為修復受損腎臟最具吸引力的細胞。BMSCs還

2、可以通過旁分泌的形式對局部缺血或再灌流造成的腎損傷進行保護,明顯減少鄰近細胞的壞死。然而,也有研究報道單純BMSCs移植治療受損的纖維化改變的腎臟效果不佳,究其原因可能與BMSCs的移植途徑,靶向歸巢數量少以及缺乏能夠明顯改善腎間質纖維化的肝細胞生長因子(HGF)等多方面因素有關。
　　近年來,超聲造影劑(微泡)的應用已從診斷領域向治療領域拓展。微泡借助其在超聲作用下的空化作用可以作為一種基因治療的非病毒載體。超聲靶向擊破微泡(U

3、ltrasound-targetedmicrobubbledestruction,UTMD)介導藥物靶向傳輸和基因轉染是近年發(fā)展起來并被公認為有效而且很有潛力的方法。該研究設想以此特性用HGF修飾BMSCs,通過對基因轉染后的BMSCs生物學功能評價優(yōu)選聲學參數,獲得活性顯著提高的目的細胞對腎纖維化動物模型進行移植。另外,UTMD還可能改變靶器官的微環(huán)境,增強靶器官微血管通透性,使內皮細胞間隙增加,促使細胞因子分泌的改變,為BMSCs“

4、著床”于靶組織創(chuàng)造條件。通過超聲聯合微泡介導HGF修飾BMSCs移植,促進HGF-BMSCs向損傷腎臟選擇性歸巢與聚集,進而起到提高療效和改善腎纖維化的作用。將基因治療和細胞治療相結合,提高移植效率,對于抗腎纖維化的可行性、安全性及靶向性進行研究,并對其機制進行探討。
　　研究目的:
　　1.探討微泡介導治療超聲聯合聚乙烯亞胺(PEI)實現HGF修飾BMSCs的有效性,可行性及其機制。試圖探索一種非病毒的方法來實現BMSCs

5、的高效轉染從而避免病毒轉染將會引發(fā)的安全問題;
　　2.探討一定參數配比條件下的診斷超聲聯合微泡對于大鼠腎間質毛細血管通透性的改變情況以及對于腎臟形態(tài)結構和功能的影響;
　　3.探討診斷超聲聯合微泡作用下靜脈移植BMSCs促進其歸巢單側輸尿管梗阻模型受損腎臟的可行性及其機制;
　　4.探討診斷超聲聯合微泡介導BMSCs和HGF修飾的BMSCs移植應用于延緩大鼠腎纖維化進程的有效性、可行性、安全性及可能機制,為探討腎纖維

6、化新的治療手段提供實驗基礎。
　　研究方法:
　　1.微泡介導治療超聲聯合PEI轉染大鼠骨髓間充質干細胞的體外研究
　　采用貼壁培養(yǎng)法對大鼠BMSCs進行分離培養(yǎng)。并通過生長曲線、細胞周期、透射電鏡等檢測其生物學特性。用流式細胞儀檢測細胞表面標記分子并成脂、成骨誘導分化進行細胞鑒定。構建質粒DNA:pEGFP-HGF。按照均勻實驗設計,對超聲強度,微泡濃度,超聲輻照時間三個主要影響因素進行考察,通過對細胞密度,轉染效率

7、,細胞存活率的檢測,最終優(yōu)選出最佳的轉染參數配比。對轉染后BMSCs的細胞周期,分化能力進行檢測。運用激光共聚焦熒光顯微鏡對轉染后48h,7d的BMSCs熒光表達進行觀察。掃描電鏡觀察超聲聯合微泡作用對于細胞造成的損傷以及細胞的自行恢復情況。
　　2.微泡介導診斷超聲對健康大鼠腎臟通透性的影響及安全性研究
　　診斷超聲聯合微泡作用采用不同的超聲發(fā)射方式(連續(xù)式超聲輻照,間歇式超聲輻照)于健康大鼠腎臟。采用Evansblue(

8、EB)定量分析,HE染色,透射電鏡對靶器官腎臟間質區(qū)毛細血管通透性的改變進行觀察檢測;通過激光共聚焦熒光顯微鏡對DIO標記微泡的靶器官釋放的定位及相對定量進行觀察分析;對尿蛋白進行檢測,評價該方法對腎小球濾過、腎小管重吸收的影響。
　　3.診斷超聲聯合微泡促進BMSCs歸巢模型大鼠腎臟的研究
　　構建單側輸尿管梗阻(UUO)模型,采用影像學和病理學方法評價模型的建立。于建模后7d,采用超聲聯合微泡介導HGF-BMSCs靜脈移

9、植。分組:模型大鼠移植HGF-BMSCs組(UM組);模型大鼠+超聲+微泡+HGF-BMSCs組(UUM組),健康大鼠移植HGF-BMSCs組(CM組);健康大鼠+超聲+微泡+HGF-BMSCs組(CUM組)。激光共聚焦觀察示蹤各組腎臟的綠色熒光陽性細胞計數和統計學分析。HE染色和透射電鏡觀察各組移植后靶組織形態(tài)結構和間質毛細血管超微結構。免疫組化對受損腎臟歸巢相關因子SDF-1表達進行定量分析。
　　4.診斷超聲聯合微泡經靜脈移

10、植BMSCs改善大鼠腎纖維化的研究
　　構建單側輸尿管梗阻再通(RUUO)模型,采用影像學和病理學方法評價模型的建立。建模后7d進行干細胞移植治療,于14d解除輸尿管梗阻。在建模后7d,14d,21d,28d四個時相點分別對RUUO組,BMSCs組,US+MB+BMSCs組和US+MB+HGF-BMSCs組進行觀察。采用影像學方法對腎臟形態(tài)進行觀察;HE染色,Masson染色對腎小管間質損害進行觀察和病理評分;RealtimePC

11、R檢測肝細胞生長因子(HGF),轉化生長因子-β(TGF-β)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達;免疫組織化學檢測α-SMA表達;westernblot檢測SDF-1,α-SMA表達。生化檢測血清肌酐,血清尿素氮和內生肌酐清除率評價腎臟功能改變。
　　結果:
　　1.微泡介導治療超聲聯合PEI轉染大鼠骨髓間充質干細胞的體外研究
　　成功分離培養(yǎng)BMSCs,檢測結果顯示絕大部分細胞表達CD44,CD29和CD90,幾

12、乎不表達CD34,CD45和CD11b。成脂誘導培養(yǎng)后油紅O染色胞漿脂滴形成,成骨誘導后茜素紅染色鈣結節(jié)形成。超聲聯合微泡協同PEI轉染BMSCs最佳參數:聲強(Q)=0.6W/cm2,微泡(MB)=106/ml,輻照時間(T)=30s時,pEGFP-HGF轉染效率38.81±2.58％和BMSCs細胞存活率82.10±1.77%達到一個相對比較匹配的數值。不同影響因素比較PEI:DNA+MB+US組同其他各組有統計學差異(P<0.05

13、),激光共聚焦觀察發(fā)現轉染后直到7d仍可見綠色熒光蛋白表達。轉染后7d,PEI:DNA+MB+US組的轉染效率為57.43±1.56%(圖12F),而細胞活性下降到78.98±3.11%。轉染后的BMSCs細胞周期及分化能力檢測G1期的細胞占82.93%,成脂誘導培養(yǎng)后油紅O染色胞漿脂滴形成,成骨誘導后茜素紅染色鈣結節(jié)形成。Westernblot檢測細胞中HGF蛋白的表達:轉染pEGFP-HGF成功表達HGF蛋白,而對應的空白對照組和轉

14、染pEGFP-N1組未檢測到目的蛋白。掃描電鏡觀察到超聲聯合微泡最佳條件作用后,BMSCs的細胞膜上可以看到微小的孔,大小不一,形態(tài)各異。7天后,BMSCs基本恢復,大多數的微孔已經消失,細胞表面基本光滑。
　　2.微泡介導診斷對大鼠腎臟通透性的影響及安全性
　　Evansblue定量分析連續(xù)式超聲輻照組(CUS)和間歇式超聲輻照組(IUS)同對照組比較沒有明顯差異(P<0.05)。超聲聯合微泡作用(UTMD)后,無論CUS

15、+MB組還是IUS+MB組的EB含量同其它三組比較都呈現顯著增加,組間差異顯著(P<0.05)。UTMD后6小時,在IUS+MB6h組EB含量達到3.15±2.20μg/g,同IUS+MB組相比較,下降顯著。UTMD后24小時,IUS+MB24h組EB含量達到0.690±0.540μg/g,這與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。病理學檢測提示UTMD后間質受損,可見紅細胞的漏出,腎間質內毛細血管連續(xù)性中斷,腎小球未受到明顯損傷。而

16、腎間質的損傷在24h內能夠自身恢復。激光共聚焦掃描熒光顯微鏡觀察到DIO標記的MB在腎間質靶向釋放,同其它臟器比較具有顯著差異。其中IUS+MB組(IOD=2092.17±342.36)和CUS+MB組(IOD=943.48±179.07)同對照組和右腎比較顯著增加,有統計學差異(P<0.05)。IUS+MB組同CUS+MB組相比較,呈現出顯著的增加(P<0.05)。尿檢結果顯示各組的尿蛋白水平在正常范圍內(-)到(++),均未觀察到蛋

17、白尿的顯著變化。
　　3.診斷超聲聯合微泡促進BMSCs歸巢模型大鼠腎臟的研究
　　成功構建UUO模型。激光共聚焦觀察示蹤靜脈移植BMSCs歸巢梗阻側腎臟,在健康大鼠移植HGF-BMSCs組(CM組)和健康大鼠+超聲+微泡+HGF-BMSCs組(CUM組)的腎臟組織切片上沒有觀察到綠色熒光表達;而在模型大鼠移植HGF-BMSCs組(UM組)和模型大鼠+超聲+微泡+HGF-BMSCs組(UUM組)腎小管間質區(qū)內觀察到胞漿內表達

18、綠色熒光的細胞,分別為(16.41±5.37)個、(86.39±8.49)個,差異有統計學意義(P<0.01)。HE染色光鏡下觀察發(fā)現UTMD作用后的模型大鼠腎間質的毛細血管破裂,大量紅細胞漏出,間質結構疏松,水腫,腎間質通透性顯著增加。透射電鏡顯示了類似的結果。免疫組織化學檢測歸巢相關因子SDF-1,CM組和CUM組SDF-1表達定位遠曲小管和極少近曲小管的胞漿中,UM組和UUM組定位在大部分的腎小管上皮細胞胞漿中,甚至在個別細胞的膜

19、上也有表達。UUM組(22146.49±1920.73)高于UM組(18643.94±2046.29),差異不顯著,P>0.05,與CUM組(5528.36±1021.81),CM組(5162.38±1376.54)的組間差異有統計學意義,P<0.05。
　　4.診斷超聲聯合微泡經靜脈移植BMSCs改善大鼠腎纖維化的研究
　　成功構建RUUO模型。超聲觀察各組腎臟在不同時相點(建模后7d,14d,21d,28d)的形態(tài)變化,

20、US+MB+BMSCs組和US+MB+HGF-BMSCs組同RUUO組和BMSCs組比較差異顯著。腎小管間質病變的病理積分發(fā)現在術后21d和28dUS+MB+BMSCs組和US+MB+HGF-BMSC組的病理積分開始明顯低于BMSCs組和RUUO組(P<0.05)。其中28d時US+MB+HGF-BMSC組較其他三組差異顯著(P<0.05)。Real-timePCR檢測不同時相點各組腎臟組織致纖維化轉化生長因子TGF-β的基因表達:14

21、d后移植BMSCs的三個治療組與RUUO組比較,差異顯著(P<0.05);診斷超聲聯合微泡作用的兩個BMSCs移植治療組表達減低,較單純BMSCs移植組差異顯著(P<0.05);在14d和21d兩時相點,US+MB+HGF-BMSCs組與US+MB+BMSCs組比較,差異顯著(P<0.05)。肝細胞生長因子(HGF)的基因表達:在14d和28d兩個時相點,US+MB+BMSCs組和US+MB+HGF-BMSCs組的HGF表達較RUUO組