靶向uAR的胰腺癌雙模態(tài)分子探針構建及體內(nèi)MR-光學成像研究.pdf

1、第一部分:胰腺癌靶向uPAR的雙模態(tài)分子探針的構建
　　研究背景:根治性手術切除對于早期胰腺癌患者而言，是非常重要的預后因素。如果能在術中確定原發(fā)腫瘤的浸潤邊界及局部侵犯的范圍，將會顯著降低腫瘤的復發(fā)及轉移，提高病人的生存期?；谏限D換納米顆粒(upconversion nanoparticles，UCNP)的分子影像探針為胰腺癌邊界的檢測帶了巨大希望。這些上轉換納米材料與傳統(tǒng)的染料非常不同，它們能夠吸收和結合多個低能光子，通過反

2、斯托克過程釋放單一的高能光子即近紅外(near-infrared，NIR)發(fā)射光，有效地提高了光穿透組織的能力。并且，由于生物體內(nèi)沒有熒光體具有相似的性質，自身熒光干擾可以在其成像中完全避免，從而增強了圖像的信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)。此外，上述納米顆?；|中含有順磁性稀土元素釓(Gd)，顆粒本身具有本征的磁共振和上轉換特性，為雙模態(tài)分子探針的構建提供了理想載體。酶的活性是腫瘤侵襲的關鍵因素，以酶直接作

3、為成像靶點將有助于我們明確腫瘤浸潤的邊界。尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinaseplasmin-ogen activator receptor, uPAR)屬于絲氨酸蛋白酶，它與其配體尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen，uPA)結合后，調節(jié)多條信號通路，這些信號通路關系到細胞外基質的降解，細胞的遷移，腫瘤的轉移擴散以及腫瘤血管生成等方面，促進了腫瘤的浸潤。這種在胰腺癌邊界及腫瘤間質細胞中高度表達的

4、膜外受體，為腫瘤邊界成像提供了非常有價值的靶點。重組的氨基末端片段(amino termino fragment，ATF)是uPA與受體結合的結構域，它可以作為靶向探針與上轉換納米顆粒載體連接，構建主動靶向探針UCNP-ATF。該探針改變了傳統(tǒng)熒光造影劑單一的、下轉換發(fā)光的成像模式，增強了圖像的信噪比及光穿透深度，整合了目前先進的納米技術、分子靶向和多模態(tài)成像，有望實現(xiàn)對胰腺癌邊界的判定。
　　目的:制備以順磁性稀土納米顆粒為基質

5、的高發(fā)光強度上轉換納米顆粒，并對其表面生物相容性及功能化修飾;探討制備方法和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾等因素對uPAR靶向的磁共振/上轉換發(fā)光納米顆粒的晶體表征、光學性質及弛豫時間的影響;合成重組的多肽ATF;研究UCNP-ATF的磁共振/上轉換發(fā)光納米顆粒在體外對人胰腺癌細胞(SW1990)的靶向結合能力。
　　方法:通過高溫法合成了NaGdF4∶Yb，Er納米顆粒。為進一步增強發(fā)光強度，通過

6、種子生長法，用NaGdF4∶Yb，Er制備了具有殼核結構的新型納米顆粒NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4.通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)掃描，檢測NaGdF4∶Yb，Er及NaGdF4∶Yb，Er@NaGdF4納米顆粒的粒徑、形態(tài)等本征特性，并采用光譜掃描進行光學性質的研究。通過配體交換法將PEG的磷酸鹽和馬來酰亞胺基團置換到核殼納米顆粒上，使其具有水溶性及生物相容性，

7、并利用發(fā)光光譜，表征修飾前后上轉換發(fā)光的穩(wěn)定性。同時，我們采用了臨床使用的3.0 T MRI(SiemensMAGNETOM Skyra)，對修飾后的納米顆粒的弛豫率進行了表征。通過PCR擴增的方法，獲取uPAR1-135的氨基末端片段的cDNA。重組多肽ATF的特異性擴增片段經(jīng)載體pET30α的轉化，在大腸桿菌DH5α株中表達，并用Ni2+-NTA柱進行純化。將提純產(chǎn)物分別用Bradford法以及SDS-PAGE、Western-Bl

8、ot檢測，從而確定產(chǎn)物的純度和濃度。隨后，通過上轉換納米顆粒表面上的馬來酰亞胺殘基與多肽ATF發(fā)生反應，完成UCNP-ATF探針構建。最后，通過動態(tài)光散射(Dynamic light scattering，DLS)表征UCNP-ATF探針在PBS中的水合尺寸，并使用相同方法，偶聯(lián)相同分子量的不相關鼠蛋白，構建非靶向性探針UCNP-mIgG作為體外細胞實驗的對照。在與靶向和非靶向探針共同孵育以后，人胰腺癌細胞系SW1990經(jīng)流式MarkⅡ

9、及MRI掃描后，分別在磁共振及近共聚焦顯微鏡下成像，檢測探針體外與細胞的結合能力。
　　結果:標準化Er3+粒子濃度以后，光譜結果顯示包殼后納米顆粒的整體發(fā)光強度是包殼前強度的70倍，表明核殼結構顯著增強了納米顆粒的發(fā)光強度。并且，TEM圖像顯示，包殼后納米顆粒的尺寸、形態(tài)幾乎沒有發(fā)生改變，平均粒徑為18.6±0.9nm。PEG修飾后的水溶性非核殼結構和核殼納米顆粒，在PBS中的光譜結果顯示，兩種顆粒的發(fā)光強度明顯下降，這可能是由

10、于水分子的高能振動模式增加了激發(fā)態(tài)的非輻射弛豫所致。盡管包殼過程對PEG配體置換過程所造成的發(fā)光淬滅并沒有明顯改善，但是核殼納米顆粒仍較非核殼結構的納米顆粒高57倍。細胞體外實驗MRI成像結果顯示，包殼后的納米顆粒其摩爾弛豫率r1較包殼前稍有下降，考慮與納米粒徑稍有增加相對減小了顆粒比表面積，導致表面Gd3+離子比例相對減少有關。通過Ni柱提純的重組ATF，以BSA為標準，用Bradford方法測定其濃度為0.4mg/ml，經(jīng)考馬斯亮藍

11、染色的SDS-PAGE及Western-Blot分析其純度約90％。探針UCNP-ATF構建前后的DLS結果顯示，探針構建后水合尺寸明顯增大，說明納米顆粒與多肽連接成功，并且DLS上沒有出現(xiàn)其它明顯的峰位，表明在連接過程中沒有形成沉淀或較大的聚集體。對人胰腺癌細胞系SW1990孵育靶向探針的ImageStream流式MarkⅡ顯示圖像，UCNP-ATF探針能夠與細胞膜表面識別結合。MRI結果同樣證實，靶向探針比起非靶向探針對細胞有明顯的

12、T1信號增強作用及特異性。
　　結論:1.制備了強上轉換發(fā)光效率的小粒徑(＜30nm)生物相容性納米顆粒。2.合成了多肽ATF，并與上述生物相容性納米顆粒連接，構建了uPAR靶向的雙模態(tài)探針。3.細胞體外實驗證明了該探針具備靶向人胰腺癌的主動識別能力。
　　第二部分:胰腺癌靶向uPAR的雙模態(tài)分子探針體內(nèi)MR/光學成像研究
　　研究背景:對于探針的成像研究，除了敏感特異的成像手段，建立能更好表現(xiàn)出腫瘤血管生成，腫瘤病理

13、生理過程以及腫瘤微環(huán)境的動物模型，同樣也是非常關鍵的。由于稀土納米顆粒有著先進的生物相容性及多功能化修飾的特性，NaGdF4∶ Yb，Er納米顆粒通過主動靶向的方式能夠成功實現(xiàn)皮下小于2mm的腫瘤探測。比起皮下腫瘤模型，動物原位模型對于模擬人體腫瘤真實的微環(huán)境及較高的腫瘤轉移率都有著很高的優(yōu)越性。然而，由于建模過程復雜及目前納米材料糟糕的生物學表現(xiàn)，在動物原位腫瘤模型中，開展的分子探針體內(nèi)成像的研究并不多見。據(jù)最近的文獻稱，靶向uPAR

14、的多肽熒光探針被報道用于原位胰腺癌的成像研究中，然而，腫瘤信號卻受到周圍組織嚴重的自發(fā)熒光干擾，很難分辨。因此，無論是原位腫瘤模型的建立，還是開發(fā)適合體內(nèi)成像的新型光學探針，目前都面臨著諸多挑戰(zhàn)。
　　目的:通過胰腺癌原位動物模型開展雙模態(tài)成像及病理學評估，探索uPAR靶向的磁共振/上轉換發(fā)光腫瘤納米探針在判定胰腺癌邊界的成像應用，為下一步術中導航奠定基礎。
　　方法:通過外科手術建立裸鼠原位胰腺癌種植模型。為了在體監(jiān)測腫瘤

15、生長情況，穩(wěn)定轉染綠色熒光蛋白(GFP)及螢火蟲熒光素酶(Luciferase)基因的SW1990細胞系(GFP-Luc-SW1990)被用于監(jiān)測腫瘤的發(fā)展。我們將慢病毒載體（PRRL-EF1 a-GFPluc-WPRE）轉染到SW1990細胞中。通過細胞流式儀分析細胞GFPluc表達情況。之后，將40uL含有5×106個GFP-Luc-SW1990細胞的懸液注入裸鼠胰腺后，通過生物自發(fā)光活體成像儀(bioluminescence im

16、aging，BLI)驗證腫瘤模型是否構建成功。在原位模型構建成功的基礎上，通過對腫瘤感興趣區(qū)的信號測量，篩選發(fā)光強度相近的裸鼠模型作為實驗組和對照組。隨后，通過鼠尾靜脈注射3 mg/mL（15 mg Gd/Kg體重）靶向探針UCNP-ATF，分別于注射前、注射后第2、4、6小時行MRI成像及上轉換發(fā)光成像。隨后，通過MRI T1 Mapping序列對腫瘤區(qū)域的T1絕對值進行兩個時間點比較，測算出探針MRIT1時間縮短。同樣，在注射后第2

17、、4、6小時，實驗動物模型胰腺區(qū)域行上轉換成像。實驗結束后，荷瘤小鼠斷頸處死，胰腺組織隨即石蠟切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。實驗模型其余正常組織，經(jīng)電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀ICP檢測，觀察探針組織分布情況。
　　結果:細胞流式結果顯示GFP及Luciferace雙報告基因轉染SW1990細胞的效率高達99.99％。原位種植裸鼠腫瘤模型建立10天后，BLI成像顯示建模成功率達90％。MRI成

18、像研究顯示，探針于腫瘤T1增強的峰值時間出現(xiàn)在注射后第4個小時，在第4個小時腫瘤區(qū)域T1信號下降達21％。上轉換成像結果表明，上轉換發(fā)光最大強度時間也出現(xiàn)在第4個小時，之后隨時間持續(xù)下降。探針組織分布情況顯示，大部分探針集中在正常肺臟部位，但攝取量非常低，還不及注射總量的10％，表現(xiàn)出很好的安全性。
　　結論:基于上轉換發(fā)光納米顆粒的UCNP-ATF探針，在體內(nèi)能夠實現(xiàn)微小胰腺癌的檢測，在分子及組織水平上明確腫瘤的邊界，展現(xiàn)出了在