胰腺癌靶向治療新靶位的研究.pdf

1、本研究從蛋白水平對(duì)其進(jìn)行了研究，探討其與胰腺癌的相關(guān)性及作為胰腺癌靶向治療的可行性，從而為胰腺癌單克隆抗體治療提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 為了探討HEC-252作為胰腺癌靶向治療靶標(biāo)的可行性，我們首先合成了HEC-252胞外區(qū)多肽，與載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)偶聯(lián)免疫動(dòng)物，制備多克隆抗體；然后用細(xì)胞免疫熒光和激光共聚焦技術(shù)確定HEC-252基因的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞膜；免疫組織化學(xué)法確

2、定了其在人體正常組織、多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中的表達(dá)譜；免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了HEC-252的表達(dá)與胰腺癌的相關(guān)性；繼而制備并篩選抗HEC-252-蛋白胞外區(qū)多肽CQ14的鼠源性單抗，在胰腺癌動(dòng)物移植瘤模型中評(píng)價(jià)這一抗體對(duì)胰腺癌的治療作用，并為進(jìn)一步研制人源化抗體藥物奠定基礎(chǔ)。經(jīng)過綜合分析，結(jié)果如下：一.利用HEC-252基因C末端的14個(gè)氨基酸(CQ14)((C)RHNWGQGFRLGDQ)作為免疫原可成功制備抗HEC-2

3、52胞外區(qū)多肽的多克隆抗體，血清滴度最高可達(dá)到10-9。免疫熒光顯示HEC-252在胰腺癌SuitⅡ細(xì)胞膜表面呈典型的環(huán)狀或戒指樣的膜表達(dá)。HEC-252蛋白在正常永生化細(xì)胞HEK293中，僅表達(dá)于細(xì)胞漿，不表達(dá)于細(xì)胞膜，而在腫瘤細(xì)胞中除細(xì)胞漿表達(dá)外，細(xì)胞膜也有一定陽性表達(dá)(卵巢癌細(xì)胞系SKOV3：98％；乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453：90％；結(jié)腸癌細(xì)胞系CL187：70％，胰腺癌細(xì)胞SuitⅡ約50％)。HEC-252的免疫組化顯

4、示，其在正常十二指腸、睪丸、肝中均有一定表達(dá)；與對(duì)應(yīng)正常組織相比，在人肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、肺腺癌等多種腫瘤組織中均表達(dá)上調(diào)。在胰腺癌中，84.0％(68/81)胰腺癌組織HEC-252呈強(qiáng)陽性表達(dá)，明顯高于癌旁73.3％及正常胰腺組織23.5％(P＜0.05)。臨床病理相關(guān)性分析未顯示HEC-252的表達(dá)與病理分級(jí)和TNM分期相關(guān)。 二.利用HEC-252基因C末端的14個(gè)氨基酸(Cq14)((C)RHNWGQGFRLG

5、DQ)作為免疫原可成功制備抗HEC-252胞外區(qū)多肽的單克隆抗體。獲得了28株體外與Cq14多肽反應(yīng)較強(qiáng)的克隆。進(jìn)一步對(duì)這28株克隆作了細(xì)胞免疫熒光的鑒定，根據(jù)細(xì)胞免疫結(jié)果選取8株進(jìn)行亞類鑒定和亞克隆分選。純化了這8株單克隆抗體，IgG和IgM純度均＞95％，以此作了8對(duì)胰腺癌及配對(duì)正常胰腺組織的免疫組化，根據(jù)免疫組化選定了2株單抗，準(zhǔn)備進(jìn)一步研究它們?cè)隗w內(nèi)外對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)等生物學(xué)行為的影響，為開發(fā)靶向HEC-252基因的抗胰腺癌單抗