新型MRI熒光雙模態(tài)探針實現(xiàn)CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞靶向成像的研究.pdf

1、第一部分非靶向MRI熒光雙模態(tài)探針的構(gòu)建及表征
　　目的：合成一種新型的非靶向 MRI熒光雙模態(tài)探針 CdTe·BSA-Gd3+，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行表征。
　　材料與方法：
　　1.近紅外量子點CdTe的合成：1）稱取Te（50.8 mg）、NaBH4（75.6 mg）裝入圓底燒瓶（10 ml）中，密封后80℃水浴反應(yīng)，生成NaHTe前體，室溫保存?zhèn)溆茫?）將CdCl2（228 mg）溶于40 ml雙蒸水中，加入巰基丙

2、酸128μl。調(diào)節(jié)pH至11-12。室溫下通N2除氧20 min，升溫至90℃后加入1.3 ml合成的NaHTe，維持N2通氣，加熱至100℃，反應(yīng)4 h后，每隔15 min取樣并檢測，當(dāng)波長達(dá)到750±20 nm時終止，得到近紅外CdTe量子點，冷卻備用。
　　2. BSA-Gd3+-DTPA的合成：1）稱取BSA粉末200 mg，溶于3 ml NaHCO3溶液中（0.1 mol/L，pH=8.5）。將DTPAA（200 mg）

3、溶于1 ml DMSO溶液，充分?jǐn)嚢韬笾鸬渭尤胫罛SA中，調(diào)pH至8.5，室溫反應(yīng)2 h，得到BSA-DTPAA溶液。利用檸檬酸鈉溶液去除多余的DTPAA和DMSO，純化備用。2）將100 mg GdCl3溶解于1 ml CH3COONa溶液（0.1 mol/L，pH=6.0），緩慢滴加至BSA-DTPA，室溫反應(yīng)24 h，檸檬酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH=6.5）透析，純化后凍干得到粉末狀BSA-Gd3+-DTPA，4℃保存?zhèn)溆?/p>

4、。
　　3. CdTe·BSA-Gd3+非靶向MRI熒光雙模態(tài)探針的合成與純化：稱取EDC·HCl3.8 mg，NHS4.6 mg，分別溶解于200μL雙蒸水。先以EDC溶液將CdTe活化，再加入NHS溶液，室溫反應(yīng)15 min。將活化的CdTe溶液滴加至5 mg凍干的BSA-Gd3+-DTPA粉末，充分溶解（摩爾比CdTe:BSA-Gd3+-DTPA:EDC:NHS=1:15:4000:8000）。NaOH（1 mol/L）調(diào)p

5、H值至8-9，室溫反應(yīng)2 h，得到CdTe·BSA-Gd3+。低溫超速離心純化，85000轉(zhuǎn)/秒×30 min，除上清，重復(fù)3次，終產(chǎn)物分散于PBS（10 mM, pH=7.4），保存?zhèn)溆谩?br>　　4. CdTe·BSA-Gd3+的表征：采用粒徑分析儀檢測量子點的粒徑；透射電鏡（TEM）觀察量子點的形態(tài)及分布；熒光分光度計比較CdTe量子點和CdTe·BSA-Gd3+的光學(xué)性能；3.0T核磁共振成像儀測試CdTe·BSA-Gd3+探

6、針的弛豫性能及體外MR成像。
　　結(jié)果：粒徑分析儀及透射電鏡結(jié)果顯示近紅外CdTe量子點粒徑約2.5~3.0 nm，形態(tài)為分布均一的球形顆粒；熒光分光度計測得 CdTe·BSA-Gd3+波長約729 nm，與CdTe的741 nm相仿，達(dá)到近紅外量子點標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的光學(xué)性能，紫外燈下觀察呈現(xiàn)像明亮的紅色熒光；體外弛豫性能測得CdTe·BSA-Gd3+的r1、r2為17.874×10-3 L· mmol-1·ms-1和26.957

7、×10-3 L· mmol-1ms-1，r2/r1值為1.515，為順磁性納米顆粒，可用于T1成像。體外MR成像顯示隨著Gd3+濃度的增加，CdTe·BSA-Gd3+探針的T1加權(quán)信號逐漸增強(qiáng)。
　　結(jié)論：所構(gòu)建的非靶向CdTe·BSA-Gd3探針，不僅具有近紅外量子的光學(xué)特性，同時又有良好的弛豫性能，為構(gòu)建針對CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的靶向探針奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分靶向MRI熒光雙模態(tài)探針對CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的體外

8、成像研究
　　目的：檢測靶向MRI熒光雙模態(tài)探針CdTe·BSA-Gd3+·Ab在體外對SU2s細(xì)胞的靶向成像能力。
　　材料和方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：SU2s細(xì)胞株為經(jīng)證實CD133受體高表達(dá)的細(xì)胞株。將SU2s細(xì)胞株接種于無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并加入神經(jīng)干細(xì)胞所需營養(yǎng)因子，37℃，5％ CO2的培養(yǎng)箱中孵育。倒置顯微鏡觀測細(xì)胞生長情況。
　　2.細(xì)胞毒性實驗：采用改良MTT法，比較 CdTe量子

9、點和 CdTe·BSA-Gd3+·Ab對SU2s細(xì)胞的活力影響。
　　3. CdTe·BSA-Gd3+·Ab靶向性雙模態(tài)探針的合成與純化：按照1:15:4000的摩爾比加入CdTe·BSA-Gd3+、CD133單克隆抗體和EDC·HCl偶聯(lián)劑,低溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)產(chǎn)物通過高速離心分離純化，得到的CdTe·BSA-Gd3+·Ab溶解分散在PBS中。
　　4.探針對 SU2s細(xì)胞的靶向熒光成像研究：取對數(shù)期 SU2s細(xì)胞與CdT

10、e·BSA-Gd3+、CdTe·BSA-Gd3+·Ab共同孵育5、10、20、30 min后觀察。
　　5.探針對 SU2s細(xì)胞的靶向 MR成像研究：取對數(shù)期 SU2s細(xì)胞分別與CdTe·BSA-Gd3+、CdTe·BSA-Gd3+·Ab、Gd-DTPA（馬根維顯）、生理鹽水共同孵育30 min，3.0 T磁共振觀察并比較T1加權(quán)成像。
　　結(jié)果：細(xì)胞毒性實驗顯示，CdTe·BSA-Gd3+·Ab與CdTe量子點相比，其細(xì)胞