中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系收集、整理及分子遺傳學(xué)和臨床病理特征分析.pdf

1、大腸癌中約25％有遺傳背景。其中家族性腺瘤性息肉病(FAP)占1％，遺傳性非息肉性大腸癌占5％～10％。其余則為散發(fā)性、炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎和克隆病)等。遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌是一種常染色體顯性遺傳病，錯(cuò)配修復(fù)基因失活所致細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)功能的喪失或缺陷，引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的發(fā)生，是遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌的主要發(fā)病機(jī)制。 目前已克隆出的錯(cuò)配修復(fù)基因，包括：hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPSM1、hPSM2、hMSH3、

2、hMSH5、hMLH3和EXO1等。其中hMSH2與hMLH1的突變?cè)谶z傳性非息肉病性結(jié)直腸癌中起主要作用，兩者的突變占所有錯(cuò)配修復(fù)基因突變檢出的80％～90％以上，因此，hMSH2與hMLH1基因的突變是目前研究熱點(diǎn)。 如何應(yīng)用一種有效的篩查檢測基因突變方法仍在探索中。隨著遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系遺傳學(xué)方面的研究，針對(duì)現(xiàn)有個(gè)體的研究已不能滿足有關(guān)遺傳學(xué)方面的深入研究。長期研究需要將家系成員的遺傳物質(zhì)保留和存儲(chǔ)，以便在今后相

3、當(dāng)長時(shí)間使研究能夠繼續(xù)下去。因此，提出建立遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系永生化細(xì)胞株的概念。應(yīng)用新型免疫抑制劑環(huán)孢素A來建立EB病毒轉(zhuǎn)化的外周血淋巴母細(xì)胞，是方法學(xué)上的一大突破。 從分子遺傳表型和臨床表型來看，東西方國家由于存在地域、民族等差異，表現(xiàn)出遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌在分子遺傳表型和臨床表型不同，目前，遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌的診斷在國際上普遍采用Amsterdam診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是由于該標(biāo)準(zhǔn)在臨床使用過程中暴露出一些不足，各

4、國紛紛提出了一些新的標(biāo)準(zhǔn)，如韓國人提出的可疑遺傳性非息肉病性結(jié)直腸診斷標(biāo)準(zhǔn)、瑞典人提出瑞典人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)等。結(jié)合我國實(shí)際國情，全國遺傳性大腸癌協(xié)作組針對(duì)中國人腫瘤發(fā)病特點(diǎn)提出了中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，以便能正確了解中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌的分子遺傳學(xué)和臨床特征。本研究收集、整理符合中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)的31個(gè)家系，針對(duì)收集整理的31個(gè)中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系臨床病理特點(diǎn)予

5、以分析，評(píng)價(jià)中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)的臨床應(yīng)用價(jià)值。分析中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1、hMSH2遺傳突變的特點(diǎn)，同時(shí)建立家系永生化細(xì)胞株。 第一部分中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直癌家系臨床病理特征分析 目的：分析評(píng)價(jià)中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系的臨床病理特點(diǎn)。 方法：收集整理符合中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)家系31個(gè)家系，記錄的數(shù)據(jù)包括患者性別、結(jié)直腸癌發(fā)生的

6、部位、診斷年齡、是否有多原發(fā)性結(jié)直腸癌及結(jié)腸外腫瘤特點(diǎn)、臨床分期、大體類型、組織分化程度、癌細(xì)胞黏液成分、有無腫瘤壞死等。按照Amsterdam診斷標(biāo)準(zhǔn)(含標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ、Ⅱ)、日本標(biāo)準(zhǔn)、可疑HNPCC標(biāo)準(zhǔn)、Bethesda指導(dǎo)綱要、中國人HNPCC標(biāo)準(zhǔn)分為AC組、JC組、sHNPCC組、BG組、CHNPCC組，另收集同期散發(fā)性結(jié)直腸癌35例作為對(duì)照，不同標(biāo)準(zhǔn)間進(jìn)行臨床病理特點(diǎn)比較。 結(jié)果：31個(gè)家系共發(fā)生136例次惡性腫瘤(多原發(fā)腫瘤

7、14例)，其中結(jié)直腸癌患者106例次，占所有腫瘤患者的77.9％，診斷年齡均數(shù)48.6±29.0歲；胃癌14例，占所有腫瘤患者的10.3％；左半結(jié)腸癌和直腸癌占所有結(jié)腸癌的52.8％(56/106)；107個(gè)腫瘤患者中男性69個(gè)，女性38個(gè)，男女比例1.6：1，先證者診斷年齡均數(shù)44.8±9.7歲。符合AC者(含ACⅠ和ACⅡ)13個(gè)，符合JC者19個(gè)，符合sHNPCC者18個(gè)，符合BG者31個(gè)，患第一癌平均年齡5組不同標(biāo)準(zhǔn)的患者分別與

8、SCRC組相比較差異有顯著性(P＜0.01)。第一癌發(fā)病年齡小于50歲患者的比例前5組明顯高于SCRC組(P＜0.05)，前5組間比較差異無顯著性。 Duke's分期中，AC組、JC組、sHNPCC組、BG組、CHNPCC組屬于A/B期例數(shù)明顯多于SCRC組，前5組A/B期例數(shù)和C/D期例數(shù)與SCRC組比較差異有顯著性(P＜0.05)。Crohn's病樣淋巴反應(yīng)顯著者AC組、BG組、CHNPCC組明顯高于SCRC組(P＜0.01

9、)。AC組、sHNPCC組、BG組、CHNPCC組外生性生長的比例高于SCRC組，AC組、BG組、CHNPCC組外生性生長和非外生性生長比例與SCRC組比較有差異顯著性P＜0.01)，sHNPCC組與SCRC組比較有差異顯著性P＜0.05)。腫瘤分化程度高中分化與低分化相比較，AC組、sHNPCC組、BG組、CHNPCC組與SCRC組有差異顯著性(P＜0.01)。腸外相關(guān)性惡性腫瘤共30例，占所有腫瘤患者的22.1％(30/136)，男

10、女性別比1.8：1，其中胃癌14例，占腸外相關(guān)性惡性腫瘤的46.3％(14/30)，多原發(fā)結(jié)直腸癌9例，結(jié)直腸癌并發(fā)腸外惡性腫瘤5例(其中胃癌4例，卵巢癌1例)。各組腸外腫瘤胃癌是第一位。 結(jié)論：(1)中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系成員結(jié)直腸癌發(fā)病年齡早于散發(fā)性大腸癌近20年。先證者發(fā)病時(shí)年齡與與西方國家報(bào)道相近。(2)中國人HNPCC家系臨床特點(diǎn)表現(xiàn)與西方國家比較不同是左半結(jié)腸癌和直腸癌多見、多原發(fā)結(jié)直腸癌比率較低、腸外惡

11、性腫瘤以胃癌最常見等。(3)中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系結(jié)直腸癌預(yù)后好于散發(fā)性大腸癌。 第二部分變性高效液相色譜儀檢測中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸家系錯(cuò)配修復(fù)基因hMSH2、hMLH1突變 目的：建立并評(píng)價(jià)用變性高效液相色譜儀檢測錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1、hMSH2基因突變的方法；分析符合中國人遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)家系hMLH1、hMSH2基因遺傳性突變特點(diǎn)。結(jié)合不同診斷標(biāo)準(zhǔn)，分析評(píng)價(jià)中國人遺傳性非息肉性結(jié)

12、直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。以及檢測的基因突變和非突變家系成員患惡性腫瘤的臨床病理特點(diǎn)，分析評(píng)價(jià)中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系的基因突變與臨床表型的關(guān)系。 方法：取31個(gè)符合中國人遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)的遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌家系腫瘤先證者外周血DNA樣品，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及變性高效液相色譜儀篩查hMLH1和hMSH2基因的突變，然后對(duì)變性高效液相色譜儀圖形異常的樣本進(jìn)行測序。以Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)、Japanese標(biāo)準(zhǔn)、Bet

13、hesda指導(dǎo)、Chinese標(biāo)準(zhǔn)分為4組，觀察每組基因突變情況。以及檢測的基因突變和非突變家系成員患惡性腫瘤的臨床病理特點(diǎn)。 結(jié)果：31個(gè)符合中國人遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)的家系腫瘤先證者中共檢出分屬于17個(gè)不同家系的23個(gè)堿基變異位點(diǎn)，經(jīng)DNA序列分析，共證實(shí)外顯子突變10個(gè)(10/31，32.9％)，其中3個(gè)為同義突變未引起蛋白質(zhì)序列的改變，另外7個(gè)為病理性改變，分別為3個(gè)錯(cuò)義突變、2個(gè)無義突變、2個(gè)移碼突變。10個(gè)突變

14、中7個(gè)突變位點(diǎn)(其中病理性突變4個(gè))均為首次報(bào)道。另在外顯子區(qū)還檢測到5個(gè)已知SNP，內(nèi)含子區(qū)檢測到8個(gè)堿基改變，其中5個(gè)為已知SNP，3個(gè)意義尚不明確。兩個(gè)家系成員有突變，其中一個(gè)家系成員中5個(gè)成員存在相同突變，其中一個(gè)確診結(jié)腸癌，4個(gè)攜帶者。另一個(gè)家系成員中3個(gè)攜帶。31個(gè)家系在不同標(biāo)準(zhǔn)預(yù)示突變敏感方面，符合Japanese標(biāo)準(zhǔn)組發(fā)現(xiàn)突變占89.5％。Bethesda指導(dǎo)組和Chinese標(biāo)準(zhǔn)組其次，均為74.2％。Amsterda

15、m標(biāo)準(zhǔn)組發(fā)現(xiàn)突變占比例最低，為61.5％。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不同標(biāo)準(zhǔn)預(yù)示突變率差異無顯著性(P＞0.05)。基因突變與臨床表型結(jié)果分析差異無顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論：(1)變性高效液相色譜儀檢測hMLH1、hMSH2基因雜合性突變高效、簡便、重復(fù)性好。(2)符合中國人遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)家系約有1/3可檢出hMLH1、hMSH2基因遺傳性種系突變，其中錯(cuò)義突變、同義突變較多見。(3)中國人遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌家系標(biāo)準(zhǔn)即

16、能體現(xiàn)遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌家系普遍的臨床特征，也能反映出中國人群及腫瘤瘤譜的一些特征。 第三部分中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系的收集整理和永生化細(xì)胞系的建立 目的：收集、整理符合中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)的31個(gè)家系成員，盡最大可能提取外周血，建立永生化細(xì)胞系。 方法：按照中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集、整理31個(gè)家系，其中27例為浙江省內(nèi)，4例為其他省市。31個(gè)家系共有成員329

17、例，簽署知情同意書并提取外周血者251例，EDTA抗凝管共收集外周血5-8ml低溫保存，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液提取淋巴細(xì)胞，EB病毒轉(zhuǎn)化同時(shí)加入環(huán)孢素A制成永生化細(xì)胞株，觀察建株成功率。 結(jié)果：成功提取外周血者占所有家系成員的76.3％，轉(zhuǎn)化成功218個(gè)樣品，轉(zhuǎn)化成功率為93.2％，建株成功208個(gè)樣品，建株成功率82.9％，建株的平均時(shí)間是18天。 結(jié)論：首次建立中國人遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌家系永生化細(xì)胞株，對(duì)人類遺傳學(xué)