遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌基因表達(dá)譜的初步研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌基因表達(dá)譜的初步研究姓名：盛霞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：施達(dá)仁20100425復(fù)旦大學(xué)攻讀博士學(xué)使戮究生摯妲論文中文摘要測(cè)分析，將I張PCC分為具有MMR缺陷表型組(MLHl和／或MSH2基因突變和／或蛋白表達(dá)缺失)和無MN依缺陷表型組；然后應(yīng)用AffymetrixHGU133plus20寡核苷酸基醫(yī)芯片技術(shù)對(duì)50仞JHnPCC及同期7例散發(fā)性結(jié)直腸癌腫瘤組織進(jìn)行了人類全基因組表

2、達(dá)譜芯片檢測(cè)，通過SAM(significanceAnalysisofMicroarray)軟件和交集分析，篩選出符合不同臨床標(biāo)準(zhǔn)的HNPCC與SCRC、MMR缺陷表型組與SCRC組之間的差異表達(dá)基因，分析與SCRC不同的HNPCC基因表達(dá)譜特征，確定與MMR缺陷表型密切相關(guān)的基因；對(duì)顯著表達(dá)差異的基因采用real—timePCR和免疫組化進(jìn)行驗(yàn)證，以期發(fā)現(xiàn)HNPCC發(fā)生酉能相關(guān)的基因，找到代表MMR缺陷表型的分予標(biāo)簽。本研究共分為三個(gè)

3、部分：第一部分ItNPCC家系矗勉s!髓溯嬲基因突變及蛋白表達(dá)分析露的：對(duì)50例符合不同臨床標(biāo)準(zhǔn)的HNPCC家系先證者病理資料進(jìn)行分析并完成hMSH2、hMLh“l(fā)蛋白及其中26例基因突變檢測(cè)。方法：符合Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)家系7個(gè)、復(fù)量標(biāo)準(zhǔn)家系9個(gè)和Bethesda指導(dǎo)綱要患者34例收入本項(xiàng)臨床病理研究。收集家系先證礱外周盤樣本10ml|以供提取基因組DNA，以7例同期散發(fā)性結(jié)直腸癌為對(duì)照。利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增2個(gè)基因共35個(gè)外顯

4、子，PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行DNA測(cè)穿，并對(duì)濺序結(jié)果進(jìn)行分析。免疫組化采瘸EnvisionS步法。結(jié)果：在26個(gè)HNPCC先證者中共發(fā)現(xiàn)8個(gè)hMSH2／hMLHI突變，其中符合AC標(biāo)準(zhǔn)的4側(cè)(4／8)，BG標(biāo)準(zhǔn)4例。50例中蛋白表達(dá)缺失17側(cè)(16／50)，包括已檢測(cè)到突變的8例。結(jié)論：hMSH2、蟊^魎臃基因突變率及蛋白表達(dá)缺失率分別為308％和34％；免疫組化檢測(cè)錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)對(duì)錯(cuò)配修復(fù)基因的突變有很好的初篩作用，Amsterdam

5、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)預(yù)示突變最敏感。仍有一部分符合臨床標(biāo)準(zhǔn)的HNPCC患者不能檢測(cè)到MMR基因的異常。第二部分HNPCC基因表達(dá)譜特征的研究毽的：篩選HNPCC與SCRC、具有MMR缺陷表型組與SCRC組差異基因。方法：收集第一部分50例HNPCC患者及闖期7例SCRC耨鮮腫瘤標(biāo)本，Trizol法提取組織RNA，制備靶標(biāo)(雙鏈eDNA合成、純化，體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記cRNA、純化、片段化)，利用Affymetrix真核表達(dá)譜芯片雜交，清洗染色并掃描