遺傳性非息肉病性大腸癌（HNPCC）家系研究.pdf

1、目的: 遺傳性非息肉病性大腸癌(herediarynonpolyposiscolorectalcancer，HNPCC)是一常染色體顯性遺傳性疾病。約占大腸癌(colorectumcancer，CRC)總數(shù)的5％～15％。1913年Warthin首次描述遺傳性非息肉病性大腸癌病例。但直到半個世紀(jì)后1966年Lynch等才更詳細(xì)地描述了這些家系的遺傳和臨床病理特征，又稱Lynch綜合征。 MMR基因種系突變是發(fā)病的分子遺傳

2、學(xué)基礎(chǔ)，該基因的突變可導(dǎo)致錯配修復(fù)蛋白的截短或表達(dá)低下，復(fù)制時錯誤增加，微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)而使腫瘤發(fā)生。HNPCC家系的發(fā)生與hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2、hMSH3以及hMSH6這六個人類MMR基因突變有關(guān)。其中hMSH2與hMLH1突變在HNPCC中起主要作用，占MMR基因突變90％以上，而hPMS1和hPMS2基因突變分別與6％的HNPCC腫瘤相關(guān)。因此檢測hMSH2與hMLH1突變與高風(fēng)險家系疾病表型的關(guān)系

3、非常有價值。 Vasen等研究報告：錯配修復(fù)基因突變hMSH2與hMLH1攜帶者一生發(fā)生CRC及HNPCC相關(guān)癌的概率相同均為80％，因此找出家系中的無癥狀的基因突變攜帶者，估計這些高危人群發(fā)生腫瘤的風(fēng)險，制定監(jiān)測方案，使HNPCC腫瘤的預(yù)防和早期診斷成為可能。大腸是多發(fā)癌發(fā)生最多的部位多發(fā)癌多見，經(jīng)驗表明接受隨診的患者比未接受隨診患者的大腸癌發(fā)生率降低65％。 環(huán)境因素對遺傳是有影響的，地域不同外顯率不同，腸外腫瘤發(fā)生

4、的部位的比率不同，基因突變譜不同，歐美研究報道，hMSH2突變檢出率高于hMLH1，而亞洲人hMLH1突變多見，近幾年來，國外的報道越來越多，而我國本民族家系詳細(xì)的系統(tǒng)的特別是大樣本的報道很少。因此，檢測中國人的MMR基因突變并研究其特殊的規(guī)律對預(yù)防和處理中國人的HNPCC有重要意義。 研究目的 探討中國人主要是我國東北地區(qū)HNPCC臨床特征及分子機理，分析HNPCC患者錯配修復(fù)基因(MMR)hMSH2、hMLH1遺傳性

5、突變率與大腸癌發(fā)生的關(guān)系，對于已發(fā)現(xiàn)存在遺傳性錯配修復(fù)基因的患者，檢測其家族中的其他成員(特別是尚未出現(xiàn)腫瘤的年輕成員)，確認(rèn)突變基因攜帶者，對癌癥易感個體重點進行臨床監(jiān)測和臨床癥狀出現(xiàn)前的早期診斷，為今后的遺傳咨詢和基因治療提供依據(jù)。 方法: 1.詳細(xì)詢問家族史，以先證者為核心繪出HNPCC家系圖，并用系譜分析方法確認(rèn)每個家系的遺傳方式。 2.獲得患者的詳盡臨床及病理學(xué)資料包括：①確診惡性腫瘤時的年齡、性別；②

6、腫瘤發(fā)生的部位(包括腸外癌)；③同時多原發(fā)結(jié)腸癌；④異時多原發(fā)結(jié)腸癌；細(xì)胞分化程度等。 3.采集組織標(biāo)本，抽取患者及直系健康的外周血抗凝-80℃保存?zhèn)溆?，以行基因檢測。 4.DNA提?。猴柡吐然c方法。 5.引物的設(shè)計與合成：從GeneBank下載MLH1及MSH2基因的35個外顯子的序列，用DNAstar軟件設(shè)計其PCR引物并進行合成。 6.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR擴增)：應(yīng)用LATaq酶分別對MLH1及M

7、SH2基因的35個外顯子進行擴增，產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 7.SSCP檢測：PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行非變性聚丙烯凝膠電泳，用銀染試劑盒進行銀染色，篩查突變。(由于時間關(guān)系本實驗略) 8.序列測定：對于PCR產(chǎn)物，經(jīng)TakaraDNAFragmentPurificationKitVer2.0純化后進行測序。 結(jié)果: 1.33個符合Amsterdam診斷標(biāo)準(zhǔn)HNPCC家系中，確診HNPCC的患者187例，原發(fā)癌

8、灶共計219個(含異時多原發(fā)癌灶和同時多原發(fā)癌灶)。33個家系腫瘤的發(fā)病規(guī)律均為常染色體顯性遺傳。 2.187例HNPCC患者，男性103例，女性84例，平均發(fā)病年齡50歲。第一代患者的平均年齡61歲，第二代患者平均年齡為56歲，第三代患者平均年齡為41歲，第四代有5人發(fā)病，平均年齡25歲，表現(xiàn)為發(fā)病年齡逐代提前的趨勢。 3.187例者中共發(fā)生原發(fā)癌灶219個，大腸癌灶134個，占總癌灶的61％腸外癌灶85個占總癌灶的3

9、9％，其中肺癌占腸外癌灶20％，胃癌占15％，子宮內(nèi)膜癌占14％。 4.187例患者中，大腸癌患者109例，占HNPCC患者的58％。大腸多發(fā)癌23例，占大腸癌的21％。異時性病灶(都不是早期癌)最短發(fā)生時間2年，最長發(fā)生時間16年，平均7年發(fā)生第二個病灶。重復(fù)癌5例。 5.該研究首先進行16個先證者MSH2基因PCR產(chǎn)物測序，MLH1基因PCR產(chǎn)物測序工作正在進行中。 6.MSH2突變率為25％；突變類型主要為

10、移碼突變，其次為錯義突變；突變分布在MSH2基因的7、11、13、15外顯子。 討論HNPCC診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床上HNPCC的診斷主要靠家族史和臨床特征，進一步的驗證診斷是錯配修復(fù)基因的檢測。該文家系選擇嚴(yán)格遵守Amster-dam標(biāo)準(zhǔn)，因為該標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)嚴(yán)格，小的家系很難符合這一標(biāo)準(zhǔn)而無法診斷，文獻(xiàn)報道應(yīng)用Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)，HNPCC約占結(jié)直腸癌的1％～6％。 HNPCC腫瘤的特點：1.惡性腫瘤發(fā)生早：此組HNPCC確診

11、平均年齡50歲，Lynch報道遺傳性非息肉病性大腸癌平均發(fā)病年齡為45歲左右，而散發(fā)性腸癌平均發(fā)病年齡大約63歲。此組第一代患者的平均年齡61歲，第二代患者平均年齡為56歲，第三代患者平均年齡為41歲歲，第四代有5人發(fā)病，平均年齡25歲，表現(xiàn)為發(fā)病年齡逐代提前的趨勢，沒隔一代，其惡性腫瘤發(fā)生年齡約提前10歲。2.大腸癌最為常見：這是此病的最大特點，本組187例患者中大腸癌患者數(shù)109例，占HNPCC患者的58％。原發(fā)癌灶219個，大腸癌

12、灶134個，占總癌灶的61％。3.多原發(fā)性大腸癌多見：此組多原發(fā)性大腸癌患者占大腸癌總數(shù)的21％，有4例病人行4次手術(shù)每2年一次，呈現(xiàn)小腺瘤2-3年發(fā)生癌變，癌發(fā)生速度很快的特點，而一般這個過程需要8-10年，這是提出腸鏡復(fù)查每年至少一次的根據(jù)。醫(yī)生在制訂診斷、治療、隨訪計劃時，應(yīng)充分考慮這個因素，并且必須讓患者及家屬知道隨訪的重要意義。4.腸外癌灶較多、惡性腫瘤譜廣：本組腸外癌灶85個占總癌灶的39％，但值得注意的是本組腸外腫瘤中肺癌

13、發(fā)生率最高，其次是胃癌、子宮內(nèi)膜癌，與其他報告不同。西方國家腸外癌中最多見子宮內(nèi)膜癌其次卵巢癌、胃癌，日本和韓國報告胃癌最多見。未見到肺癌最多見的報告非常值得進一步研究，也許是中國北方HNPCC的腸外癌的特點。關(guān)于東、西方HNPCC表型在腸外癌種類方面的差異是否與種族、生活習(xí)慣、生存環(huán)境等不同有關(guān)，環(huán)境因素對遺傳是有影響的，地域不同外顯率不同，腸外腫瘤發(fā)生的部位的比率不同，有待進一步研究。 hMSH2突變檢測提示：1、突變率：文

14、獻(xiàn)報道HNPCC家族中最易檢測的突變?yōu)閔MSH2和hMLH1的種系突變，其突變檢出率為40％～86％，其中hM-SH2占27％～54％，本研究的突變率為25％。 hMLH1及hMSH2突變在不同的民族和地區(qū)，其陽性率不同，歐美hM-SH2突變的檢出率高于hMLH1，而亞洲人hMLH1突變多見。但在中國人的基因的突變中，hMSH2基因的突變占50％，與韓國人、日本人等亞洲的研究小組報道不同，可能中國人在錯配修復(fù)基因的突變方面有異于

15、其他亞洲人的特殊規(guī)律。因此，檢測中國人的基因的突變并研究其特殊的規(guī)律對預(yù)防和處理中國人的有重要意義。 hMLH1及hMSH2突變的攜帶者，發(fā)生結(jié)直腸癌的危險可達(dá)80％，其他腸外癌癥的發(fā)生率亦明顯增加，因此檢測hMLH1及hMSH2基因突變的攜帶者并對其進行定期復(fù)查對早期發(fā)現(xiàn)并處理結(jié)直腸癌，預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生有重要的價值。。對HNPCC患者定期進行腹部超聲、胃鏡、刮宮、宮頸涂片、經(jīng)陰道超聲檢查和血CEA及CA125檢測有利于早期發(fā)