Leber遺傳性視神經(jīng)病變家系的臨床和分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、第一部分Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者篩查及資料收集第二部分Leber遺傳性視神經(jīng)病變T14484C突變家系分子機(jī)制研究 目的：1.在全國(guó)各地收集視神經(jīng)病變家系,建立臨床資料和分子遺傳學(xué)資料數(shù)據(jù)庫(kù). 2.對(duì)收集到的家系三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)(G3460A、Gll778A、T14484C)進(jìn)行檢測(cè)是否在中國(guó)人群中存在及統(tǒng)計(jì)突變發(fā)病頻譜. 3.對(duì)其中T14484C家系進(jìn)行線粒體基因組全序列測(cè)序,分析繼發(fā)位點(diǎn)和其它影響功能的突

2、變位點(diǎn)對(duì)T14484C家系的外顯率和發(fā)病嚴(yán)重程度的影響. 4.了解T14484C突變?cè)谥袊?guó)人群中的臨床表現(xiàn)、外顯率、發(fā)病年齡、男女發(fā)病比例;分析其它因素(如核基因、環(huán)境因素、單倍型和生理心理因素等)對(duì)外顯率和發(fā)病嚴(yán)重程度的影響. 方法：1.通過(guò)溫州醫(yī)學(xué)院眼視光醫(yī)院與北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院眼科和福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院合作,建立起視神經(jīng)病變家系收集網(wǎng)絡(luò),另外還有全國(guó)各地醫(yī)院和科研院所送來(lái)的少量家系資料.經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院倫理道德

3、委員會(huì)及辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心委員會(huì)許可,病人及所有受試者同意,簽署知情同意書(shū),采集血樣,了解家系情況,并建好數(shù)據(jù)庫(kù). 2.對(duì)該家族中的所有成員進(jìn)行眼科臨床檢查,包括標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)視力表檢測(cè)視力,俞自萍色覺(jué)圖檢查,Humphrey視野計(jì)按程序SITA檢查(Humphrey Visual Field AnalyzerIIi,SITAStandard),德國(guó)羅蘭電生理儀(Roland Consult RETI port gamma,pa

4、ttern or flash VEP)檢查視覺(jué)誘發(fā)電位(VEP)以及佳能眼底數(shù)碼彩照(Canon CR6-45NM fundus camera)拍攝眼底. 3.對(duì)采集的血樣提取基因組DNA,并設(shè)計(jì)包含三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)的三對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化和測(cè)序. 4.對(duì)其中檢測(cè)出的T14484C家系設(shè)計(jì)出擴(kuò)增線粒體基因組全序列的24對(duì)引物,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化并測(cè)序. 5.使用各種生物軟件分析測(cè)序結(jié)果,找出所有的多態(tài)性位

5、點(diǎn)和突變位點(diǎn),分析其對(duì)功能的影響. 6.對(duì)收集的臨床資料進(jìn)行整理,分析其與各個(gè)突變位點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性. 結(jié)果：1.我們共收集了345個(gè)視神經(jīng)病變的家系,其中檢測(cè)出LHON三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)(G11778A、G3460、T14484C)的家系共129個(gè),在患者中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)或三個(gè)突變位點(diǎn)的情況.其中發(fā)生T14484C突變的家系有15個(gè),占三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)發(fā)病率的11.6﹪(15/129).而其它位點(diǎn)(G3316A、

6、C3394T、T3497C)家系21個(gè),G11696A突變家系14個(gè),G11696A和G11778A雙位點(diǎn)突變家系3個(gè),另外也發(fā)現(xiàn)了影響功能突變位點(diǎn)(A4435G、A15951G、A10059G)的家系各1個(gè). 2.對(duì)其中6個(gè)T14484C突變家系研究,發(fā)現(xiàn)患者發(fā)病年齡從6歲到26歲不等,平均18.9歲;視力損害程度從正常到重度不等,多為中度到重度;各個(gè)家系男女發(fā)病比分別為3:0、1:0、1:0、3:0、2:0、1:1,而男女發(fā)

7、病比為11:;各個(gè)家系外顯率分別為18.8﹪、5.9﹪、16.7﹪、23.1﹪、22.2﹪、15.4﹪,平均為16.2﹪. 3.通過(guò)對(duì)以上6個(gè)Leber遺傳性視神經(jīng)病變T14484C突變的家系線粒體基因組全序列進(jìn)行測(cè)序后分析,除了T14484C突變外,這些家系先證者線粒體DNA呈現(xiàn)一種獨(dú)特的多態(tài)性:在D-loop區(qū)總共有36個(gè)變異位點(diǎn),都已經(jīng)被報(bào)道過(guò);而在13個(gè)多肽編碼區(qū)存在著更多的變異位點(diǎn),共有65個(gè),其中25個(gè)還沒(méi)有被報(bào)道過(guò)

8、,但大多數(shù)為同義突變,共有30個(gè),而錯(cuò)義突變位點(diǎn)有25個(gè),未曾報(bào)道過(guò)的錯(cuò)義突變位點(diǎn)有11個(gè),分布于13個(gè)多肽編碼區(qū)上;在12S rRNA基因區(qū)存在3個(gè)已報(bào)道的多態(tài)位點(diǎn),在16S rRNA基因區(qū)也存在3個(gè)多態(tài)位點(diǎn),其中1719InsG未見(jiàn)報(bào)道;另外在為22個(gè)tRNA基因編碼區(qū)也存在多態(tài)性位點(diǎn)共2個(gè):tRNA<'Cys>G5821A和tRNA<'Gly>T10031C.另外在家系WZ147中存在一個(gè)與LHON有關(guān)的其它突變位點(diǎn)(G3316A

9、).對(duì)其它RNA基因區(qū)的變異位點(diǎn)和編碼區(qū)因突變發(fā)生改變的氨基酸在人、牛、鼠、蟾蜍中進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)它們?cè)谶M(jìn)化上并不保守. 4.線粒體DNA單體型的分析發(fā)現(xiàn)這6個(gè)家系的mtDNA分別屬于R11、D4、C、C4、C、M8a,說(shuō)明他們不是來(lái)自于一個(gè)中國(guó)祖先,發(fā)病呈散發(fā)現(xiàn)象. 結(jié)論：1.在中國(guó)人群中存在T14484C突變,并可使攜帶者致病,但并不是每個(gè)攜帶者都發(fā)病,發(fā)病外顯率為16.2﹪,與G11778A相比明顯為低.在160個(gè)中

10、國(guó)正常人群中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)T14484C突變的存在. 2.T14484C在中國(guó)人3個(gè)原發(fā)位點(diǎn)突變中的發(fā)病頻譜為11.6﹪. 3.在6個(gè)T14484C突變家系中發(fā)病男性明顯多于女性,男女比例為11:1,多發(fā)生在青年人身上. 4.在研究的6個(gè)T14484C突變家系中,他們的線粒體單倍型分別屬于Rll、D4、C、C4、C、M8a,并沒(méi)有找到這些單位型與外顯率和發(fā)病嚴(yán)重程度之間的聯(lián)系. 5.這些家系先證者和家系成員發(fā)病

11、,多數(shù)視力都有所恢復(fù),有的甚至不經(jīng)過(guò)治療也能恢復(fù)到正常視力,恢復(fù)率大約為75﹪,高于國(guó)外報(bào)道. 6.母系成員盡管攜帶有相同的mtDNA,但表現(xiàn)出不同的病情、發(fā)病年齡及愈后,雖然還沒(méi)有定論,但目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)HON的外顯率和表現(xiàn)度與核修飾基因、環(huán)境因素及單體型有關(guān),有待更進(jìn)一步的深入研究. 第三部分Leber遺傳性視神經(jīng)病變G11696A突變家系分子機(jī)制研究 目的：1.對(duì)其中G11696A的家系進(jìn)行線粒體基因組

12、全序列測(cè)序,分析繼發(fā)位點(diǎn)和其它影響功能的突變位點(diǎn)對(duì)G11696A家系的外顯率和發(fā)病嚴(yán)重程度的影響.2.了解G11696A突變?cè)谥袊?guó)人群中的臨床表現(xiàn)、外顯率、發(fā)病年齡、男女發(fā)病比例:分析其它因素(如核基因、環(huán)境因素、單倍型等)對(duì)外顯率和發(fā)病嚴(yán)重程度的影響. 方法：1.對(duì)其中檢測(cè)出的兩個(gè)G11696A突變家系設(shè)計(jì)出擴(kuò)增線粒體基因組全序列的24對(duì)引物,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化并測(cè)序.2.使用各種生物軟件分析測(cè)序結(jié)果,找出所有的多態(tài)性位

13、點(diǎn)和突變位點(diǎn),分析其對(duì)功能的影響.3.對(duì)收集的臨床資料進(jìn)行整理,分析其與突變位點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián). 結(jié)果：1.這兩個(gè)G11696A突變家系患者發(fā)病年齡分別為10歲和17歲,平均13.5歲;視力損害程度多為輕度到中度;各個(gè)家系外顯率分別為10.0﹪、9.1﹪,平均為9.5﹪.2.在先證者及家系成員未能檢測(cè)到最常見(jiàn)的三個(gè)原發(fā)mtDNA突變位點(diǎn)(G3460A、G11778A、T14484C),但在兩個(gè)先證者及其家系母系成員中均發(fā)現(xiàn)ND4.G

14、11696A突變位點(diǎn),并導(dǎo)致ND4亞基312位的纈氨酸變成異亮氨酸.167名中國(guó)正常對(duì)照分析發(fā)現(xiàn)只有一例是陽(yáng)性(男,25歲).這兩個(gè)家系存在許多的多態(tài)性位點(diǎn):D-100p區(qū)有10個(gè),rRNA有5個(gè),在多肽編碼區(qū)存在25個(gè)突變位點(diǎn):其中14個(gè)為無(wú)義突變,11個(gè)為錯(cuò)義突變;WZ21-Ⅲ-3還存在3個(gè)新的變異ND2亞基T4500C(S11P),ATPase 6亞基C8702T(T59I)和ND4L亞基T10663C(V65A).通過(guò)對(duì)牛、小鼠

15、、蟾蜍及人幾個(gè)不同物種保守性分析,這些發(fā)生變異的位點(diǎn)和氨基酸在進(jìn)化上并不保守.3.線粒體DNA單體型的分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)家系的mtDNA屬于D4,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有其它影響功能位點(diǎn)的存在. 結(jié)論：1.在中國(guó)人群中存在G11696A突變,并可使攜帶者發(fā)病,但并不是每個(gè)攜帶者都發(fā)病.在167個(gè)正常對(duì)照中發(fā)現(xiàn)一例G11696A突變,說(shuō)明G11696A突變不是致病的唯一因素. 2.這兩個(gè)G11696A家系都只有一名男性發(fā)病,發(fā)病年齡平均13

16、.5歲,平均外顯率極低,約為9.5﹪,遠(yuǎn)低于原發(fā)位點(diǎn)G11778A、T14484C的外顯率. 3.在研究的兩個(gè)家系中,他們的線粒體單倍型都屬于D4,可能來(lái)自一個(gè)共同的祖先,并沒(méi)有找到這個(gè)單位型D4.與外顯率和發(fā)病嚴(yán)重程度之間的關(guān)聯(lián). 4.不完全外顯率、臨床表現(xiàn)和在正常對(duì)照出現(xiàn)(1/167)表明G11696A突變本身不足以導(dǎo)致LHON的發(fā)生,可能其它因素在這兩個(gè)LHON家系的表型表達(dá)中也起一定的作用.在這些家系mtDNA中