G250異種化復(fù)合抗原抗腎癌基因疫苗的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、G250(MN/CAIX)是腎癌特異性的腫瘤相關(guān)抗原，因其在腎細(xì)胞癌中的特異性表達(dá)而廣泛應(yīng)用于腎細(xì)胞癌的免疫治療。
　　 本研究的目的是構(gòu)建含有人腎細(xì)胞癌特異性抗原G250(CAIX)主要T細(xì)胞表位區(qū)域、猴和鼠CAIX部分片段區(qū)域融合基因異種化融合抗原tG250的真核表達(dá)質(zhì)粒，并在猴腎COS7細(xì)胞中鑒定其表達(dá)情況。首先通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，確定AG250(CAIX)的主要抗原表位集中區(qū)域，并在Genebank中查找其相應(yīng)的基因序列；在G

2、enbank中查找猴和鼠的CAIX基因序列；通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)人、猴和鼠CAIX的基因序列進(jìn)行對(duì)比，保留人G250抗原表位集中區(qū)域，其余部分以猴和鼠的CAIX基因序列替代；使設(shè)計(jì)的異種化序列與除去信號(hào)肽的人G250胞外段序列同源性達(dá)到89％。然后通過(guò)基因合成和PCR拼接技術(shù)構(gòu)建人、猴和鼠G250區(qū)域融合的異種化抗原基因tG250，將其插入含有人Igκ鏈前導(dǎo)信號(hào)肽(sig)、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號(hào)肽的真核表達(dá)

3、載體pCI-Fc-GPI中，繼而又將酶切后的sig-tG250-Fc-GPI融合基因?qū)牒屑?xì)小病毒內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)( IRES)基因且可以共表達(dá)人GM-CSF和B7.1融合基因的真核表達(dá)載體pVAX1-IRES-GM/B7中，獲得G250異種化復(fù)合抗原抗腎癌DNA疫苗pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-GM/B7(簡(jiǎn)稱pVAX1-tG250FcGB)。最后，將構(gòu)建的DNA疫苗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀和免疫熒光檢

4、測(cè)其表達(dá)情況。結(jié)果：異種化復(fù)合抗原tG250融合基因經(jīng)測(cè)序正確，PCR和酶切鑒定證明已成功連入真核表達(dá)載體pVAX1-IRES-GM/B7中；流式細(xì)胞儀和免疫熒光的檢測(cè)結(jié)果顯示，重組DNA疫苗質(zhì)粒pVAX1-tG250FcGB在COS7細(xì)胞中得到很好的表達(dá)。
　　 本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：成功構(gòu)建了異種化復(fù)合抗原tG250，經(jīng)測(cè)序與預(yù)期一致.構(gòu)建的重組DNA疫苗質(zhì)粒pVAX1-tG250FcGB可以在COS7細(xì)胞中有效表達(dá)，為進(jìn)一