G250異種化復(fù)合抗原抗腎癌基因疫苗的構(gòu)建和表達.pdf

1、G250(MN/CAIX)是腎癌特異性的腫瘤相關(guān)抗原，因其在腎細胞癌中的特異性表達而廣泛應(yīng)用于腎細胞癌的免疫治療。
　　 本研究的目的是構(gòu)建含有人腎細胞癌特異性抗原G250(CAIX)主要T細胞表位區(qū)域、猴和鼠CAIX部分片段區(qū)域融合基因異種化融合抗原tG250的真核表達質(zhì)粒，并在猴腎COS7細胞中鑒定其表達情況。首先通過文獻調(diào)研，確定AG250(CAIX)的主要抗原表位集中區(qū)域，并在Genebank中查找其相應(yīng)的基因序列；在G

2、enbank中查找猴和鼠的CAIX基因序列；通過DNAMAN軟件對人、猴和鼠CAIX的基因序列進行對比，保留人G250抗原表位集中區(qū)域，其余部分以猴和鼠的CAIX基因序列替代；使設(shè)計的異種化序列與除去信號肽的人G250胞外段序列同源性達到89％。然后通過基因合成和PCR拼接技術(shù)構(gòu)建人、猴和鼠G250區(qū)域融合的異種化抗原基因tG250，將其插入含有人Igκ鏈前導(dǎo)信號肽(sig)、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號肽的真核表達

3、載體pCI-Fc-GPI中，繼而又將酶切后的sig-tG250-Fc-GPI融合基因?qū)牒屑毿〔《緝?nèi)部核糖體結(jié)合位點( IRES)基因且可以共表達人GM-CSF和B7.1融合基因的真核表達載體pVAX1-IRES-GM/B7中，獲得G250異種化復(fù)合抗原抗腎癌DNA疫苗pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-GM/B7(簡稱pVAX1-tG250FcGB)。最后，將構(gòu)建的DNA疫苗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細胞，利用流式細胞儀和免疫熒光檢

4、測其表達情況。結(jié)果：異種化復(fù)合抗原tG250融合基因經(jīng)測序正確，PCR和酶切鑒定證明已成功連入真核表達載體pVAX1-IRES-GM/B7中；流式細胞儀和免疫熒光的檢測結(jié)果顯示，重組DNA疫苗質(zhì)粒pVAX1-tG250FcGB在COS7細胞中得到很好的表達。
　　 本研究的實驗結(jié)果證明：成功構(gòu)建了異種化復(fù)合抗原tG250，經(jīng)測序與預(yù)期一致.構(gòu)建的重組DNA疫苗質(zhì)粒pVAX1-tG250FcGB可以在COS7細胞中有效表達，為進一