表達(dá)人源性G250抗體的腺病毒載體的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測Ad5-G250表達(dá)的G250全長人源性抗體的生物學(xué)活性，及其對腎癌細(xì)胞產(chǎn)生的作用，為腎癌的放射性免疫診斷和放射性免疫治療的進(jìn)一研究及腎癌的治療的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1.重組腺病毒Ad5-G250、Ad5-EGFP轉(zhuǎn)染低代HEK293細(xì)胞，大量擴(kuò)增后進(jìn)行純化，測定滴度。
　　2.Ad5-G250轉(zhuǎn)染L-02細(xì)胞，分別在3天、5天及7天后ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體的表達(dá)量。
　　3.收集細(xì)胞培養(yǎng)液，

2、利用純化預(yù)裝柱對細(xì)胞上清液進(jìn)行純化。
　　4.Western Blot檢測純化的抗體蛋白的分子量。
　　5.Western Blot檢測純化的抗體能否與細(xì)胞的G250蛋白相結(jié)合。
　　6.免疫組化法檢測Ad5-G250在體外表達(dá)的抗體是否具有生物學(xué)活性。
　　7.CCK-8法檢測Ad5-G250對腎癌細(xì)胞Ketr-3及ACHN細(xì)胞的增殖影響。
　　8.Annexin V-FITC/PI法檢測Ad5-G250

3、對腎癌細(xì)胞Kerr-3及ACHN細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：1.經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增、純化后測得病毒Ad5-G250、Ad5-EGFP的滴度分別為6.96×109pfu/ml、9.36×109pfu/ml。
　　2.Ad5-G250轉(zhuǎn)染L-02細(xì)胞，ELSA測定3天、5天和7天的G250mAb表達(dá)量分別為(213.14±49.27)ng/ml、(346.67±70.23)ng/ml和(437.25±60.16)ng/ml。

4、>　　3.Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示Ad5-G250轉(zhuǎn)染L-02細(xì)胞后能夠表達(dá)抗體的輕鏈和重鏈，且輕鏈和重鏈的濃度匹配，說明表達(dá)的抗體可以形成完整的全長抗體。
　　4.Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示純化的抗體能與表達(dá)G250蛋白的Ketr-3和786-O細(xì)胞在58KD處出現(xiàn)反應(yīng)條帶，而不表達(dá)G250的ACHN和HK-2細(xì)胞則在相應(yīng)位置無反應(yīng)條帶。
　　5.細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)見Ketr-3細(xì)胞膜被染成棕褐色，而ACHN細(xì)

5、胞未見著色。
　　6.CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，腺病毒Ad5-G250對腎癌Ketr-3細(xì)胞有抑制作用，而對ACHN細(xì)胞的抑制作用不明顯。腺病毒Ad5-G250抑制Ketr-3細(xì)胞增殖存在濃度及時(shí)間依賴性，隨著濃度的增加及時(shí)間的延長，對細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)。
　　7.AnnexinV-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡，Ad5-G250誘導(dǎo)Ketr-3細(xì)胞凋亡的作用和ACHN細(xì)胞相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05；Ad5-G2