G250膜外段基因的克隆表達及其核酸疫苗免疫效應的初步觀察.pdf

1、本文研究目的：構(gòu)建G250抗原蛋白膜外段的真核表達重組體pcDNA3.1(+)-G250，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組體轉(zhuǎn)染CHO細胞表達目的蛋白，為G250的相關后續(xù)研究提供物質(zhì)基礎；同時將表達重組體作為核酸疫苗免疫小鼠，觀察體液應答效果，為制備G250單抗及其基因疫苗的研究提供理論和實驗基礎。 研究方法：從腎癌組織終提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GeneBank上G250序列(AJ010588)設計一對含XbaⅠ位點、Hind

2、Ⅲ位點的引物，PCR擴增G250抗原基因的膜外目的片段。PCR產(chǎn)物和真核表達載體pcDNA3.1(+)分別經(jīng)雙酶切后凝膠回收純化，用T4酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。從氨芐青霉素陽性的LB板上隨機挑取單菌落，增菌并提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定和酶切鑒定，含有目的片段的為陽性重組子，采用自動序列分析儀對插入片段進行序列分析。 采用無菌操作提取并純化G250-pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染入小鼠卵巢癌上皮細胞CHO

3、細胞。轉(zhuǎn)染后24小時用G418600ug/ml選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，對G418抗性克隆用RT-PCR方法篩選鑒定陽性克隆，并擴大培養(yǎng)之。獲得穩(wěn)定生長并表達G250目的蛋白的陽性細胞株，用間接免疫熒光法檢測表達的G250膜外段蛋白在細胞中的位置。提取細胞總蛋白，用Western-Blotting法鑒定轉(zhuǎn)染細胞表達G250膜外段蛋白的分子量。 大量提取并純化G250-pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，作為核酸疫苗注射入小鼠的后肢腓腸肌，進行核酸

4、免疫。免疫4次后的小鼠血清作為一抗，腎癌標準細胞株786-0做抗原細胞，進行間接免疫熒光法檢測。以此觀察核酸免疫的體液免疫效果。 研究結(jié)果：從腎癌組織終提取總RNA經(jīng)RT-PCR擴增，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳可見一條特異條帶，位置在750bp和1000bp之間，其大小與預計片段大小基本一致，而陰性對照未見任何條帶。陽性重組子經(jīng)PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳可見目的條帶，經(jīng)雙酶切后顯示目的條帶和5.4KB的pcDNA3.1(+)條帶。

5、序列測定結(jié)果與GeneBank上G250序列(AJ010588)進行Blast分析，相應片段的同源性為100％。 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠卵巢癌上皮細胞CHO細胞，經(jīng)篩選和鑒定得到兩株穩(wěn)定表達G250膜外片段的陽性轉(zhuǎn)染細胞克隆，經(jīng)RT-PCR證實轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)存在G250膜外段的mRNA轉(zhuǎn)錄，間接免疫熒光法檢測到轉(zhuǎn)染細胞表達G250膜外段在CHO的細胞膜上。Western-Blotting法證實轉(zhuǎn)染細胞表達蛋白的分子量約為

6、32KD，與預計相符。 將重組質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫小鼠，取小鼠免疫血清，用腎癌標準細胞株786-0做間接免疫熒光法檢測，結(jié)果呈陽性。且抗體稀釋度可達1∶10。 研究結(jié)論： 1、利用RT-PCR技術成功擴增了G250膜外段編碼區(qū)cDNA,經(jīng)序列分析顯示擴增的序列正確。 2、構(gòu)建了G250膜外段真核表達載體，并建立了穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株。表達的目的蛋白為G250抗原后續(xù)的相關研究提供物質(zhì)基礎。