TRAIL胞膜外段基因克隆、表達及其純化.pdf

1、山東大學碩士學位論文TRAIL胞膜外段基因克隆、表達及其純化姓名：周海勝申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：劉賢錫田方2001.5.14將TRAIL基因的胞膜外段插入表達載體pGEX一2T，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX／TRAILex，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5c【，提取重組DNA，用酶切、PCR擴增來鑒定陽性克隆，用IPTG誘導表達GSTTRAIL蛋白的胞膜外段；使用親和層析的方法純化目的蛋白，將純化的融合蛋白作用于U937細

2、胞，用FACS檢測表達的目的蛋白是否具有生物學活性。結(jié)果：抗CD3McAb能誘導正常人外周血中淋巴細胞的TRAIL的表達，成功地克隆了TRAIL基因及其胞膜外段，構(gòu)建了重組表達載體DGEX／TRAILex，IPTG誘導后可得到高度表達的TRAIL蛋白胞膜外段，經(jīng)12％SDS～PAGE分析，可觀察到一分子量和理論值相符(約54kD)的誘導表達帶。GST—TRAIL胞膜外段融合蛋白的表達量占菌體蛋白總量的28％，進一步分析表明TRAIL蛋白

3、的胞膜外段主要以可溶性的形式表達，用GSTAgarose4B層析柱純化超聲破菌后的上清，每升細菌培養(yǎng)液可得到i05mg純度在90％以上GSTTRAIL胞膜外段的融合蛋白。在20。C用IPTG誘導重組菌表達的目的蛋白主要以可溶性的形式存在；不同濃度的IPTG對融合蛋白表達量影響較小；0immol／LIPTG在20。c誘導4小時后，目的蛋白的表達達峰值。Western—blot結(jié)果證實54kD的表達帶可與鼠抗TRAILMcAb起特異性反應。