ZS-TRAIL基因的克隆表達及其抗腫瘤活性與機理研究.pdf

1、TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligind)是腫瘤壞死因子超家族成員之一.其選擇性誘導腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無明顯殺傷作用的特性,使之成為抗腫瘤新藥研究的一個熱點。目前,TRAIL,已通過I期臨床試驗,并已進入Ⅱ期臨床研究。國內(nèi)外I期臨床結果顯示,TRAIL毒副作用低、無免疫原性,在臨床上具有較大的潛在應用價值。然而,TRAIL,存在生物活性不強的缺點.添加寡聚化結構域能有效提高TNF家族蛋

2、白的生物活性.因此,本研究在TRAIL基礎上添加入源三聚化結構域ZS,希望提高TRAIL生物活性,進而將其開發(fā)成抗腫瘤新藥.主要研究結果如下： 1、TRAIL和ZS-TRAIL基因的克隆表達及產(chǎn)物純化通過RT-PCR技術擴增人TRAIL114-281序列,通過重疊延伸PCR技術擴增人ZS-TRAIL序列,擴增產(chǎn)物克隆到大腸桿菌表達載體pET-28a,并在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)高表達。通過親和層析和離子交換層析兩步純化得

3、到目的蛋白.純化后的TRAIL和ZS-TRAIL經(jīng)反相HPLC測定純度均大于95％；經(jīng)Western印跡實驗顯示均有明顯抗原性；經(jīng)ESI質譜測定其分子量與理論值一致；CD結果顯示兩者結構緊密。 2、TRAIL和ZS-TRAIL體外抗腫瘤活性比較用SRB法測定TRAIL和ZS-TRAIL的體外抗腫瘤活性。結果顯示:TRAIL和ZS-TRAIL能有效殺傷人肺腺癌SPC-A1細胞、人回盲腸腺癌HCT-8細胞、人肝癌BEL-7402細胞

4、、人白血病HL-60細胞等多種腫瘤細胞,且呈劑量依賴性。ZS-TRAIL的腫瘤細胞殺傷能力比TRAIL強。ZS-TRAIL和TRAIL均對正常肝細胞LO2無殺傷作用。 3、TRAIL和ZS-TRAIL體內(nèi)抗腫瘤活性比較建立荷瘤裸鼠模型,比較TRAIL和ZS-TRAIL的體內(nèi)抗腫瘤活性。結果顯示,ZS-TRAIL對人回盲腸腺癌HCT-8模型和人體肺腺癌SPC-Al模型的抗腫瘤療效均優(yōu)于TRAIL,且高劑量(80mg/kg)ZS-T

5、RAIL和TRAIL對荷瘤裸鼠模型動物均無肝毒性。 4、ZS-TRAIL的體內(nèi)外抗腫瘤活性高于TRAIL的機理探討寡聚化狀態(tài)分析表明,ZS-TRAIL和TRAIL主要以高活性同源三聚體形式存在.藥物代謝動力學結果顯示,ZS-TRAIL與TRAIL半衰期無顯著差異。穩(wěn)定性分析表明,TRAIL熱穩(wěn)定性優(yōu)于ZS-TRAIL;但在貼近細胞生長條件(37℃)特別是在含人血白蛋白的條件下,ZS-TRAIL比TRAIL穩(wěn)定。推測ZS-TRAI

6、L抗腫瘤活性提高與其貼近細胞生長條件下穩(wěn)定性高有關。進一步研究發(fā)現(xiàn)ZS-TRAIL抗腫瘤活性高于TRAIL可能與其zn2+結合能力強有關。 5、ZS-TRAIL表達條件優(yōu)化用響應面法對可溶性ZS-TRAIL表達條件進行優(yōu)化,最佳表達條件為：酵母提取物11.38 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、Kan 30μg/mL、IPTG 0.1mM、誘導溫度29.2℃、誘導時間6h、ZnSO4濃度0.458mM。優(yōu)化后,可溶性