雞Mx基因的克隆、表達(dá)及其抗病活性的研究.pdf

1、Mx基因是Lindenmann在研究A2G小鼠抗流感病毒試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，因能抵抗粘液病毒而命名為Mx(myxovirus resistant)基因。關(guān)于禽類(lèi)Mx蛋白的研究，1992年首次發(fā)現(xiàn)了鴨的Mx蛋白后，雞的Mx蛋白基因也被克隆，雞的Mx蛋白的抗病毒活性受631位氨基酸的影響，當(dāng)631位氨基酸為天冬酰胺時(shí)有抗病毒活性，為絲氨酸時(shí)則無(wú)抗病毒活性。但將雞Mx蛋白用于提高雞體免疫力的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究擬探索通過(guò)對(duì)同種異體雞Mx基因進(jìn)行改

2、造構(gòu)建雞抗病毒重組基因、表達(dá)抗病毒蛋白的思路，旨意在從提高雞自身抗病毒能力上應(yīng)對(duì)禽類(lèi)病毒病的威脅探索新思路。主要研究如下： 1.以50μg/mL Poly(I)·Poly(C)誘導(dǎo)雞成纖維細(xì)胞Mx基因的表達(dá)，7小時(shí)后提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)發(fā)表文獻(xiàn)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增全長(zhǎng)Mx cDNA特異性引物，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出全長(zhǎng)Mx cDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMDl9-TSimple載體中進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果：與GenBa

3、nk發(fā)表的雞Mx cDNA序列AB088535、AY695797、NM_204609、XM_429240、Z23168的同源性分別為99.6％、99.5％、99.4％、99.7％、99.4％，說(shuō)明所擴(kuò)增的序列為本實(shí)驗(yàn)所要的。獲得的雞Mx cDNA序列在2032位堿基為G，該基因的抗病毒活性還需做進(jìn)一步研究。 2.采用簡(jiǎn)單易行的大引物PCR突變技術(shù)將雞Mx基因的全長(zhǎng)eDNA第2032位的堿基由G突變?yōu)锳(既631位氨基酸的改變)，

4、并將突變的Mx基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.O，重組表達(dá)載體經(jīng)PCR、酶切鑒定驗(yàn)證構(gòu)建正確后，提取并純化重組質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-I細(xì)胞，RT-PCR與間接免疫熒光(IFA)鑒定其表達(dá)。然后提取并純化轉(zhuǎn)染Mx基因的COS-I細(xì)胞裂解液，采用NDV-CEF微量細(xì)胞抑制試驗(yàn)，進(jìn)一步確定Mx蛋白的抗病毒活性。結(jié)果：對(duì)雞Mx基因進(jìn)行PCR誘變修飾正確，構(gòu)建了能夠正確表達(dá)雞Mx蛋白的重組真核表達(dá)載體。微量細(xì)胞抑制試驗(yàn)分析結(jié)果顯示，重組

5、Mx蛋白具有較強(qiáng)的抗新城疫病毒生物活性。 3.以酶切線(xiàn)性化的重組質(zhì)粒為目的基因，直接將目的基因通過(guò)隨機(jī)打點(diǎn)法注射入睪丸，轉(zhuǎn)染SSCs，產(chǎn)生攜帶有目的基因的成熟精子用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞。采用常規(guī)PCR．檢測(cè)技術(shù)，在DNA分子水平檢測(cè)證實(shí)外源基因(Mx)的整合。結(jié)果：PCR檢測(cè)證實(shí)外源基因(Mx)已整合到精子基因組，且能通過(guò)體外受精在后代中穩(wěn)定整合，后代PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為27.27％(6/22)。表明睪丸內(nèi)注射法可能是一種切實(shí)可行、