TRAIL對(duì)HeLa生物活性及其作用機(jī)理的初步研究.pdf

1、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-relatedapoptosis—inducingligand，TRAIL)是繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子超家族新成員，具有選擇性地誘導(dǎo)癌化或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞發(fā)生凋亡，對(duì)正常細(xì)胞及人體組織安全無(wú)毒，同時(shí)，TRAIL可以不依賴p53。因此，TRAIL受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視，有望成為新的抗腫瘤藥物。 然而，目前，TRAIL對(duì)宮頸癌的作用機(jī)理并不十分清楚，僅停留于對(duì)某一種或某幾種蛋白質(zhì)的

2、功能研究，難以在特定的時(shí)間和特定的空間整體地、系統(tǒng)地、透徹地闡釋TRAIL的作用機(jī)制。本研究以HPVl8陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞系HeLa為模型，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的TRAIL蛋白，開展了TRAIL蛋白的生物學(xué)活性，作用靶位及作用機(jī)理的初步研究，總的結(jié)果是為TRAIL的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)理提供新的理論依據(jù)。我們的研究分四個(gè)部分進(jìn)行。 第一部分 人可溶性TRAILeDNA的克隆及原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建利用基因工程技術(shù)克隆人可溶性TRAIL胞

3、外區(qū)¨4-281片段的cDNA及構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET28e㈩-sTRAIL。將pET28c(+)-sTRAIL轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)氨芐西林篩選，建立原核表達(dá)系統(tǒng)pET28c(+)sTRAIL／BL21(DE3)，該系統(tǒng)經(jīng)用1．Ommol／LIPTG誘導(dǎo)4h，得獲了TRAIL融合蛋白，純化并鑒定，表明，其分子量約為19．8kD。 第二部分 TRAil,對(duì)HeLa生物活性的研究 用TRAIL蛋白干預(yù)HeL

4、a，經(jīng)過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)；AO/EB熒光染色觀察凋亡細(xì)胞結(jié)構(gòu)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率等幾方面，觀察了TRAIL蛋白對(duì)HeLa的生物活性。結(jié)果，分別用5ng/m1，10ng／ml，20ng/m1，40ng/ml的TRAIL作用于HeLa24h，①細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)為75．98％、61．94％、28．79％和26．42％；②用AO／EB染色后，可觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞凋亡率為0％、5％、12％、28％和30％；③流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率為

5、O％、4．72％、9．91％、25．63％和32．39％；④AO／EB及流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率其結(jié)果無(wú)顯著性差異(p<0．05)。結(jié)果表明，20ng/mlTRAIL蛋白誘導(dǎo)HeLa24h，可有效抑制其生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。 第三部分 TRAIL誘導(dǎo)HeLa凋亡的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究 首先，建立了HeLa蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)。用三種不同配方的裂解液提取HeLa中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向凝膠電泳，建立和優(yōu)化HeLa蛋白質(zhì)組分析所需的樣品

6、處理方法和雙向電泳技術(shù)。結(jié)果，聯(lián)合使用尿素、硫脲和廣譜蛋白酶抑制劑，有利于提取全細(xì)胞蛋白質(zhì)，檢出堿性蛋白和增加2-DE分辨率，檢出的蛋白點(diǎn)數(shù)可達(dá)820~12。然后，利用已建立的雙向電泳技術(shù)，分離TRAIL干預(yù)與未干預(yù)的HeLa的全細(xì)胞蛋白質(zhì)，用PDQuest(7．4．0)軟件進(jìn)行比較分析、尋找差異表達(dá)蛋白，差異表達(dá)蛋白再經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，MS-Fit數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定。結(jié)果：篩選了12個(gè)明顯的差異蛋白點(diǎn)，其中，8個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上

7、調(diào)，4個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。它們分別是：JNKK，MAPKAPK-2，DIPl3beta，SHPS-1，GEM-1，DDBb，Leucine-richrepeat-containingprotein14，Macoilin；GrblOadaptorprotein，Ena／VASP-likeprotein，PTPase-MEG2andTHUMPdomain-containingprotein1． 第四部分 TRAII,誘導(dǎo)HeLa凋亡

8、的作用機(jī)理的初步研究 分別用10ng／ml、20ng/m1和40ng/mlTRAIL干預(yù)HeLa24h后，用RT-PCR半定量方法檢測(cè)HPVl8E6基因及JNK2的mRNA表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果，①隨著TRAIL劑量的增加，HPVl8E6基因的表達(dá)水平下降，而JNK2基因的表達(dá)水平增加；②細(xì)胞周期呈現(xiàn)明顯的變化：G0／Gl期細(xì)胞比例逐漸減少，由62．19％降到37．69％，而G2／M期和S期細(xì)胞比例逐漸增加，分別由1