RNAi抑制G250基因以及對(duì)腎癌786-0細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 本研究旨在探討能否在腎癌細(xì)胞系中利用人工誘導(dǎo)RNA干擾技術(shù)，抑制G250基因表達(dá)，通過體內(nèi)、外試驗(yàn)研究G250基因沉默對(duì)腎癌細(xì)胞系786-0細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，進(jìn)而了解G250基因?qū)δI癌的發(fā)生及發(fā)展的影響，為闡明腎癌的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)并為進(jìn)一步探索腎癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 第一章G250基因特異性siRNA的設(shè)計(jì)、合成及表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 利用NCBI的基因庫(GeneBank)及

2、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)4條內(nèi)含不同G250基因特異性序列的寡核苷酸干擾片斷(命名G250siRNA-1～G250siRNA-4)，并設(shè)計(jì)另一條無意義序列(命名G250siRNA-n)作對(duì)照，寡核苷酸鏈退火后用T4DNA連接酶連接到線性化的pRNAT-U6.1／Neo載體中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒載體pshRNA-G250進(jìn)行酶切及序列鑒定。 第二章siRNA表達(dá)載體抑制腎癌786-0細(xì)胞G250基因的實(shí)驗(yàn)研究 利用陽離子脂質(zhì)體L

3、ipofectaineTM2000將pshRNA-G250導(dǎo)入腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞中，用空質(zhì)粒載體做空白對(duì)照，經(jīng)G-418篩選獲得抗性單克隆，挑取熒光強(qiáng)的克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，熒光定量RT-PCR和Westernblot鑒定干擾后各組G250mRNA和G250蛋白在腎癌786-0細(xì)胞中的表達(dá)；挑選干擾效果高的克隆進(jìn)行后續(xù)的RNA干擾實(shí)驗(yàn)。 第三章G250基因沉默后對(duì)腎癌786-0細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究 利用MTT法

4、觀察轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的4組腎癌786-0細(xì)胞(高干擾效率2組為si-G250-a、si-G250-b，干擾陰性對(duì)照和干擾空載體，分別命名為786-0／si-G250-a、786-0／si-G250-b、786-0／si-G250-n和786-0／si-G250-0)體外增殖情況。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的2組腎癌786-0細(xì)胞(786-0／si-G250-b、786-0／si-G250-0)為研究對(duì)象，利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、侵

5、襲實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G250基因表達(dá)沉默對(duì)腎癌786-0細(xì)胞體外增殖、侵襲及運(yùn)動(dòng)能力的影響；采用流式細(xì)胞技術(shù)和TUNEL，技術(shù)檢測(cè)G250基因表達(dá)沉默后誘導(dǎo)腎癌786-0細(xì)胞凋亡，同時(shí)采用流式紐胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布的改變。 結(jié)果： 第一章G250基因特異性siRNA的設(shè)計(jì)、合成及表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 采用pRNAT-U6.1／Neo質(zhì)粒載體，構(gòu)建了針對(duì)靶基因G250的4個(gè)RNA干擾載體pshRNA-G250(分

6、別稱為重組質(zhì)粒pshRNA-G250-1，pshRNA-G250-2，pshRNA-G250.3，pshRNA-G250-4)及一個(gè)陰性干擾對(duì)照載體(稱為重組質(zhì)粒pshRNA-(3250-n)，質(zhì)粒pshRNA-G250線性化后加入退火后形成的寡核苷酸雙鏈進(jìn)行連接時(shí)原限制型內(nèi)切酶KpnI的酶切位點(diǎn)被破壞，而重組成功的質(zhì)粒pshRNA-G250沒有被限制型內(nèi)切酶KpnI線性化，酶切證實(shí)pshRNA-G250表達(dá)載體克隆構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒測(cè)

7、序結(jié)果通過軟件進(jìn)行比對(duì)，插入片段測(cè)序與預(yù)先設(shè)計(jì)結(jié)果完全相符。說明已將不同序列的siRNA分別成功克隆至載體pRNAT-U6.1／Neo上。 第二章siRNA表達(dá)載體抑制腎癌786-0細(xì)胞G250基因的實(shí)驗(yàn)研究 熒光定量PCR顯示各實(shí)驗(yàn)組的G250mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組均有不同程度的下降。pshRNA-G250-1，pshRNA-G250-2，pshRNA-G250-3，pshRNA-0250-4對(duì)G250mRNA表達(dá)的

8、抑制效率分別為35.56％，49.27％，45.88％，65.13％，以G250siRNA-2、G250siRNA-4對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒pshRNA-G250-2，pshRNA-G250-4抑制效率最高。Westernblot檢測(cè)干擾后各組G250蛋白，結(jié)果顯示G250蛋白的表達(dá)量從pshRNA-G250-n，pshRNA-G250-1，pshRNA-G250-3，pshRNA-G250-2，pshRNA-G250-4依次遞減。含干擾效率高

9、的干擾片斷和陰性對(duì)照的腎癌786-0細(xì)胞經(jīng)G-418篩選獲得抗性單克隆用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 第三章G250基因沉默后對(duì)腎癌786-0細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究 MTT法觀察G250基因表達(dá)沉默后體外細(xì)胞的增殖情況，與786-0／si-G250-0細(xì)胞及786-0／si-G250-n細(xì)胞相比，786-0／si-G250-a、786-0／si-G250-b細(xì)胞增殖速度減慢，四組差異顯著(F=360.17，P=0.000)；平板克

10、隆形成實(shí)驗(yàn)顯示：與786-0／si-G250-0細(xì)胞一樣，786-0／si-G250-b細(xì)胞同樣能在平板中形成克隆，14天時(shí)二組細(xì)胞克隆形成率分別為(27.027±3.987)％、(18.117±1.647)％，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.578，P=0.023)。結(jié)果表明，786-0／si-G250-0細(xì)胞克隆形成率較786-0／si-G250-b細(xì)胞高。這個(gè)結(jié)果也顯示786-0／si-G250-b細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞增殖能力在G25

11、0基因表達(dá)沉默后降低，腎癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)被顯著抑制。 應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)G250基因表達(dá)沉默誘導(dǎo)腎癌786-0細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期改變的結(jié)果表明，786.0／si-G250-b、786-0／si-G250-0細(xì)胞G0／G1期比例分別為(59.97±3.26)％、(44.73±2.29)％，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.620，P=0.003)；S期分別為(32.83±2.73)％、(41.27±1.21)％，兩者相比差異有統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)意義(t=4.889，P=0.008)；G2／M期細(xì)胞分別為(7.17±1.40)％、(14.00±1.08)％，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.676，P=0.003)。結(jié)果表明，786-0／si-G250-bG0/G1期比例較786-0／si-G250-0細(xì)胞高，而S期、(32／M期比例較786-0／si-G250-0細(xì)胞低，表現(xiàn)出G0/G1期阻滯，說明G250基因表達(dá)沉默抑制了腎癌細(xì)胞的DNA合成，將細(xì)胞阻滯于G0/G1期。

13、TUNEL法凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G250基因表達(dá)沉默誘導(dǎo)腎癌786-0細(xì)胞凋亡結(jié)果表明786-0／si-G250-b、786-0／si-G250-0的凋亡率分別是(21.537±3.552)％、(6.590±1.167)％，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.925，P=0.002)，說明G250基因表達(dá)沉默可以誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的凋亡。 動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，5×106個(gè)786-0／si-G250-b、786-0／si-G250-0細(xì)胞

14、皮下接種BALB／c裸鼠均成瘤，786.0／si-G250-b、786-0／si-G250-0組腫瘤出現(xiàn)時(shí)間分別為(11±1.5)d、(15±2.4)a，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.381，P=0.007)。786-0／si-G250-b、786-0／si-G250.0組裸鼠的7個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤的生長(zhǎng)體積具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=-84.836，P=0.000)。成瘤3周后，干擾組瘤塊明顯小于對(duì)照組瘤塊，瘤塊稱重結(jié)果顯示，對(duì)照組和干擾組

15、裸鼠的腫瘤重量分別為(37.353±9.332)pmg、(22.224±5.145)mg，(t=3.475，P=0.006)，干擾組腫瘤成瘤抑制率為40.50％。結(jié)果顯示，干擾組腎癌786-0細(xì)胞BALB／c裸鼠移植瘤成瘤及生長(zhǎng)受到抑制，說明G250基因表達(dá)沉默抑制了腎癌細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力。 腫瘤組織病理改變：成瘤組織經(jīng)HE病理切片鑒定均為透明細(xì)胞癌，癌細(xì)胞排列成腺管狀。癌細(xì)胞體積大，多邊形，輪廓清楚，胞漿富含脂質(zhì)、糖原而淡染呈

16、空泡狀，核小而深染，圓形，位于邊緣或中央，形態(tài)不規(guī)則，可見明顯的腫瘤細(xì)胞。786-0／si-G250-b組可見少量腫瘤壞死細(xì)胞。 結(jié)論： 1.RNA干擾技術(shù)可特異高效地抑制腎癌786-0細(xì)胞G250基因的表達(dá)，使G250mRNA及蛋白的表達(dá)量均有顯著下降。找到了具有較高抑制效率的siRNA并合成了其表達(dá)載體。 2.G250基因?qū)δI癌786-0細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲有促進(jìn)作用，而對(duì)腎癌786-0細(xì)胞的凋亡有抑制作用

17、，抑制G250基因的表達(dá)可誘導(dǎo)腎癌786-0細(xì)胞的凋亡并將786-0細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期的G0／G1期。抑制G250基因的表達(dá)可以抑制腎癌786-0細(xì)胞BALB／c裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，使移植瘤成瘤時(shí)間延長(zhǎng)、生長(zhǎng)減慢，它有望成為腎癌基因治療的靶點(diǎn)。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)： 1.證實(shí)G250基因?qū)δI癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲有促進(jìn)作用，首次發(fā)現(xiàn)沉默G250基因的表達(dá)可明顯誘導(dǎo)腎癌786-0細(xì)胞的凋亡并將其細(xì)胞周期阻滯于G0／G1期。